急性胰腺炎患者血清葡萄糖调节蛋白78、miR-181-5p的表达及意义

郑 洲, 付 桥

(湖北省武汉市第三医院, 1. 急诊科, 2. 泌尿外科, 湖北 武汉, 430014)

急性胰腺炎(AP)是胰腺的一种炎症性疾病, 80%患者病情轻微，无严重并发症，总体病死率为5%, 但重症AP患者的病死率可高达30%[1]。miRNA是一种高度保守的非编码RNA, 包含18～24个核苷酸，通过抑制mRNA的翻译或促进mRNA的降解而成为基因表达的负调节因子[2]。自噬在AP的发病中起着非常重要的作用，可导致胰腺腺泡细胞中胰蛋白酶原激活并引起炎症反应的发生和加剧[3]。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)也称为热休克蛋白家族A成员5(HSPA5), 属于HSP70家族，是一种内质网应激相关蛋白，对细胞有保护作用[4]。在饥饿条件下，内质网中心的蛋白质合成发生改变，可使未折叠和错误折叠的蛋白质积累，造成内质网应激，最终导致细胞自噬[5]。HSPA5可识别错误折叠的多肽，并与蛋白酶结合使其降解，参与细胞自噬过程[6]。研究[7]显示, miR-181可通过调控线粒体自噬的发生参与锯齿状腺瘤癌变的过程。本研究检测AP患者血清GRP78、miR-181-5p表达水平并分析其临床意义，以期为临床防治AP提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年9月—2020年9月武汉市第三医院收治的141例AP患者作为研究对象，患者均符合《中国急性胰腺炎多学科诊治(MDT)共识意见(草案)》[8]的相关诊断标准，依据《2012版急性胰腺炎分类: 亚特兰大国际共识的分类和定义的修订》[9]将患者分为轻症组86例和重症组55例。纳入标准: ① 发病前无消化道疾病史、内分泌疾病史者; ② 病历资料完整者; ③ 入院前未接受AP相关治疗者。排除标准: ① 慢性胰腺炎患者;② 近3个月内使用激素或免疫抑制剂治疗者; ③ 存在严重心、肺、肾等器官功能障碍者; ④ 合并免疫缺陷病、急慢性肝炎、恶性肿瘤及外伤者。另选取同期体检的健康人员100例纳入对照组。收集受试者的体质量指数(BMI)、收缩压、舒张压、冠心病、糖尿病、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等一般资料。本研究经武汉市第三医院医学伦理委员会审核批准后实施，且所有患者及其家属签署知情同意书，研究方法符合《赫尔辛基宣言》的要求。

1.2 主要试剂与仪器

Trizol试剂(美国Invirotrogen公司，货号15596026); 反转录试剂盒(上海吉至生化科技有限公司，货号RP1105-50T); SYBR Premix Ex Taq TM real-time PCR试剂盒(大连TaKaRa公司); 实时荧光定量PCR仪(美国Applied biosygtems公司，型号7300型); 医用离心机(北京时代北利离心机有限公司型号, DT5-6); 全自动生化分析仪(上海罗氏诊断产品有限公司，型号Cobas c 701); 引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。

1.3 方法

1.3.1 样品采集及保存: 受试者入院后经肘静脉穿刺抽取外周血3 mL, 静置30 min, 室温下3 000转/min离心15 min, 吸取上清液即得血清，装入EP管中，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 生物信息学分析: 通过检索生物信息学在线数据库Targetscan(http: //www.targetscan.org/)预测miR-181-5p与GRP78的靶向结合情况。

1.3.3 血清miR-181-5p、GRP78 mRNA表达水平检测: 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测。按照Trizol法提取AP患者血清总RNA，用分光光度计测定总RNA纯度及浓度，根据逆转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。参照SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒说明书进行qRT-PCR反应，内参分别选用U6、GAPDH基因, miR-181-5p、GRP78 mRNA、U6、GAPDH引物序列见表1。反应条件: 95 ℃ 10 min; 40个PCR循环(95 ℃ 10 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 15 s)。采用2-ΔΔCt方法计算miR-181-5p、GRP78 mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 一般资料比较

3组受试者年龄、性别及TC、TG、LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。轻症组、重症组初诊时白细胞(WBC)水平高于对照组，血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 重症组初诊时WBC水平高于轻症组，Hb、PLT水平低于轻症组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组受试者一般资料比较

2.2 血清miR-181-5p、GRP78 mRNA表达水平比较

重症组、轻症组血清miR-181-5p表达水平高于对照组, GRP78 mRNA表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 重症组血清miR-181-5p表达水平高于轻症组, GRP78 mRNA表达水平低于轻症组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组血清miR-181-5p、GRP78 mRNA表达水平比较

2.3 血清miR-181-5p、GRP78 mRNA表达水平的相关性

Targetscan网站预测, miR-181-5p与GRP78存在结合位点。Pearson相关分析结果显示, miR-181-5p与GRP78 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.665,P<0.05)。见图1。

2.4 重症AP的影响因素分析

以受试者是否发生重症AP为因变量，以受试者血清WBC、Hb、PLT、miR-181-5p、GRP78 mRNA表达水平为自变量，进行二元Logistic回归分析。分析结果显示，血清WBC、Hb、PLT不是受试者发生重症AP的影响因素(P>0.05); miR-181-5p表达水平偏高、GRP78 mRNA表达水平偏低是受试者发生重症AP的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 重症AP影响因素的二元Logistic回归分析

2.5 血清miR-181-5p、GRP78 mRNA单独及联合检测对重症AP的预测价值

ROC曲线显示，血清miR-181-5p预测重症AP的曲线下面积(AUC)为0.836(95%CI为0.759～0.913), 敏感性为85.2%, 特异性为80.3%; 血清GRP78 mRNA预测重症AP的AUC为0.741(95%CI为0.649～0.833), 敏感性为82.0%，特异性为70.5%。二者联合预测重症AP的AUC为0.861(95%CI为0.791～0.930), 敏感性为82.0%、特异性为85.2%。见图2。

3 讨 论

目前, AP的发病机制和发展规律尚未完全阐明，其中重症AP的病情尤其凶险，患者手术病死率较高。近年来, AP相关研究不断取得进展，大多数研究者认为胰酶原在胰腺细胞内非正常激活是造成AP发生的原因。胰腺细胞内胰酶原的激活机制目前尚未阐明，有研究称自噬参与了该过程，但关于自噬在该过程中起保护作用还是损害作用尚存较大争议。

GRP78蛋白的分子量为70 KDa, 主要位于内质网中，具有促进蛋白质正确折叠、保持内质网稳定、维持细胞稳态的功能，通过参与内质网应激，改变内质网形态和功能，诱导自噬发生[10]。韩世强等[11]发现, GRP78在小鼠脑缺血再灌注损伤中起保护作用，可通过促进自噬，促进神经细胞凋亡发挥作用。张志标等[12]报道, GRP78上调可修复雨蛙肽对胰腺腺泡细胞的损伤，对治疗胰腺炎有所帮助。除细胞内自噬相关蛋白参与的信号机制外, miRNA在自噬调节中也起着重要的中心作用[13]。miR-181是一种新的重要的自噬调节剂，其过度表达可导致饥饿和雷帕霉素诱导的人乳腺癌细胞、人肝癌细胞和人髓性白血病细胞自噬的减弱[14]。病理状态下，自噬受损，炎症水平升高，可能加重AP, 李霞等[15]发现AP小鼠模型中炎症水平升高，自噬相关基因表达增强。本研究中，重症AP患者GRP78 mRNA水平显著低于轻症组和对照组, miR-181-5p水平显著高于轻症组和对照组，提示GRP78、miR-181-5p可能与AP发生及病情严重程度有一定关联。

本研究显示, miR-181-5p表达水平偏高、GRP78 mRNA表达水平偏低是重症AP发生的危险因素，猜测是由于miR-181-5p过表达，抑制胰腺组织细胞自噬和GRP78 mNRA表达，而GRP78表达减弱，无法诱导自噬的发生，导致胰腺组织发生更严重的损伤。进一步分析发现，血清miR-181-5p预测重症AP的AUC为0.836(95%CI为0.759～0.913), 血清GRP78 mRNA的AUC为0.741(95%CI为0.649～0.833), 二者联合的AUC为0.861(95%CI为0.791～0.930)。由此提示, GRP78、miR-181-5p对AP进展为重症AP均具有一定预测价值，且联合检测的预测价值更高，可作为潜在的预测重症AP的生物标志物。此外, Targetscan网站预测miR-181-5p与GRP78存在结合位点，且miR-181-5p与GRP78 mRNA表达水平呈负相关，提示二者可能存在调控关系，其具体机制需在今后扩大样本量后深入探讨。

综上所述, AP患者血清GRP78 mRNA表达水平降低, miR-181-5p表达水平升高。血清miR-181-5p、GRP78与AP严重程度有关，可作为潜在的预测重症AP的标志物。本研究纳入样本量相对较少，未检测自噬相关因子，且未深入研究miR-181-5p、GRP78共同作用与AP发生发展的关系，有待后续深入探究。