丁香叶提取物通过调控SIRT1/PGC-1α/NRF1信号通路改善急性胰腺炎大鼠肝损伤

李登高, 吴胜利, 张 琼

(1. 陕西省宝鸡市人民医院 急诊科, 陕西 宝鸡, 712000;2. 陕西省宝鸡市中心医院, 陕西 宝鸡, 712000;3. 西安交通大学第一附属医院, 肝胆外科, 陕西 西安, 721000)

急性胰腺炎(AP)是可导致系统性炎症反应和多器官功能衰竭[1]。AP是一种高死亡率的常见疾病，大约20%的病例发展为严重急性胰腺炎，其病死率为30%[2]。由于肝脏在胃肠道中的特殊位置及其在代谢过程中的作用，肝脏是AP期间胰腺外器官损伤的重要部位[3]。大约80%的AP患者发生肝损伤，其严重程度与胰腺炎的严重程度呈正相关[4]。目前，尚不完全清楚AP引起肝损伤的具体机制，但是氧化应激反应在肝损伤中起关键作用。研究[5]发现，丁香叶能够调节氧化应激反应，具有明显的抗氧化活性。丁香叶提取物对大鼠肝损伤具有明显的保护作用[6], 然而丁香叶提取物对AP大鼠肝损伤的保护作用报道较少。因此，本研究拟通过构建急性AP大鼠模型，探究丁香叶提取对AP大鼠肝组织的保护作用及相关作用机制。

1 材料及方法

1.1 动物

SD雄性大鼠，体质量200～220 g, 购自哈尔滨医科大学实验动物学部，使用许可证号为SYXK(黑)2019-001。将所有动物饲养于(25±2) ℃, (50±5) %湿度的环境中, 12 h的光照/黑暗周期，适应性饲养1周，并提供充足的食物和水。所有程序均符合中华人民共和国科学技术部发布的《实验动物管理条例》。所有动物程序均按照本院批准的实验动物的护理和使用指南进行。本研究经本院动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

丁香叶采自哈尔滨郊外，经哈尔滨医科大学药学院教研室鉴定。HE染色试剂盒(货号C0105), 上海碧云天生物技术有限公司。白细胞介素(IL)-6酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(货号H007)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(货号H052), 总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(货号A001), 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(货号A005), 丙二醛(MDA)测定试剂盒(货号A003), 均购自南京建成生物工程研究所。Anti-SIRT1抗体(货号ab189494), Anti-PGC-1α抗体(货号ab188102), Anti-NRF1抗体(货号ab175932), 均购自美国Abcam公司。

1.3 实验仪器

UniCel DxC 800 Synchron全自动生化分析系统购自美国贝克曼公司; Fax-20100酶标仪购自美国INStat公司; 光学显微镜购自德国Leica公司; ECL检测系统购自美国GE Healthcare公司; 电泳仪购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 AP动物模型的制备: 将60只SD大鼠随机分成对照组、AP组、低剂量组、中剂量组和高剂量组(丁香叶提取物低、中、高剂量组)，每组12只。根据参考文献[7], 首先将大鼠麻醉，然后使用微量输液泵以0.2 mL/min的速率向胰胆管内逆行灌注3.5%牛黄胆酸钠(1 mL/kg体质量)。对照组大鼠使用生理盐水代替牛黄胆酸钠进行相同的操作。

根据姜月红等[6]研究方法，制备丁香叶提取物，二甲基亚砜(DMSO)溶解。手术操作2 h后，分别给予低、中、高剂量组的大鼠75、150、300 mg/kg的剂量灌胃给药，给药体积为5 mL, 2次/d, 连续7 d。等量的生理盐水给予对照组和AP组大鼠灌胃处理。

1.4.2 样本采集: 末次给药24 h后，将各组大鼠麻醉，通过心脏穿刺采血，并离心取上清，置于-20 ℃中保存备用。然后将大鼠处死，解剖，无菌条件下取出肝脏，称重，计算肝脏系数=肝脏质量(mg)/体质量(g)。取一部分肝脏组织使用4%多聚甲醛固定24 h，另一部分肝脏组织置于液氮速冻保存备用。

1.4.3 检测淀粉酶和肝功能指标的水平: 全自动生化分析仪检测血清中淀粉酶(AMY)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。

1.4.4 检测血清炎性因子含量: 采用ELISA法对血清中IL-6、TNF-α水平进行检测。

1.4.5 肝脏组织氧化应激指标的检测: 取出冻存在液氮中的部分肝脏组织，利用检测MDA、SOD和GSH-Px的试剂盒，分析各组大鼠肝脏组织中的氧化应激指标变化。

1.4.6 HE染色检测肝组织病理学变化: 取出固定在多聚甲醛中的肝脏组织，脱水后常规石蜡包埋，连续切片，获得5 μm厚的切片备用。HE染色后，光镜下观察肝脏组织形态学改变，并用Image-Pro Plus多功能图像分析软件对相关病理形态学指标进行测量和分析。

1.4.7 Western blot检测肝脏组织中沉默信息调节因子1(SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)、核呼吸因子(NRF1)蛋白表达水平: 取液氮中保存的肝脏组织，使用蛋白裂解液裂解总蛋白并检测蛋白含量。蛋白样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂牛奶在室温下封闭1 h，然后分别与抗SIRT1、PGC-1α、NRF1和β-actin的一抗在4 ℃孵育过夜。洗膜3次，将膜与辣根过氧化物酶偶联二抗在37 ℃孵育1 h。使用ECL检测系统检测信号，并使用ImageJ软件进行蛋白质相对表达量的分析。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠肝脏系数的比较

与对照组相比, AP组大鼠肝脏系数升高(P<0.05), 差异有统计学意义。将AP大鼠经不同剂量丁香叶提取物处理后，肝脏系数均降低，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 丁香叶提取物对AP大鼠肝脏系数的影响

2.2 各组大鼠血清中淀粉酶和肝功能指标的比较

与对照组相比, AP组大鼠血清中AMY和肝功能有关指标(ALT和AST)水平升高，差异有统计学意义(P<0.05); 低剂量、中剂量、高剂量组AMY、ALT和AST水平均降低，提示经丁香叶提取物处理，可逆转AP大鼠血清中AMY、ALT和AST的水平变化(P<0.05)。见表2。

表2 丁香叶提取物对AP大鼠血清中淀粉酶和肝功能指标的影响

2.3 各组大鼠血清中炎性因子水平的比较

与对照组相比, AP组大鼠血清中炎性因子(IL-6、TNF-α)水平上调，差异有统计学意义(P<0.05); 将AP大鼠经不同剂量丁香叶提取物处理后, AP大鼠炎性因子水平呈降低趋势(P<0.05)。见表3。

表3 丁香叶提取物对AP大鼠血清中炎性因子水平的影响

2.4 各组大鼠肝脏中氧化应激水平的比较

与对照组相比, AP组大鼠肝脏中MDA水平升高, SOD和GSH-Px水平降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与AP组相比，低剂量、中剂量、高剂量组MDA降低, SOD、GSH-Px水平均升高，提示经丁香叶提取物处理，可逆转氧化应激指标的变化(P<0.05)。见表4。

表4 丁香叶提取物对AP大鼠肝脏中氧化应激水平的影响

2.5 各组大鼠肝脏组织形态学变化

对照组大鼠肝脏组织结构正常，无明显病变; AP组大鼠肝脏组织结构损伤严重，肝细胞水肿、出血或坏死，且大量炎性细胞浸润; 与AP组相比，低、中、高剂量组大鼠肝脏组织的症状明显减轻，炎性细胞浸润减少。见图1。

2.6 丁香叶提取物对AP大鼠肝组织中SIRT1、PGC-1α、NRF1蛋白表达水平的影响

与对照组相比, AP组大鼠肝脏中SIRT1、PGC-1α、NRF1蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05); 与AP组相比，低、中、高剂量组组大鼠肝脏中SIRT1、PGC-1α、NRF1蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5、图2。

表5 丁香叶提取物对AP大鼠肝组织中SIRT1、PGC-1α、NRF1蛋白表达水平的影响

3 讨 论

AP 是胰腺的一种独特的急性炎症性疾病，也可能累及胰周组织甚至远端器官[8]。AP的病理生理机制是炎症反应，多种器官功能障碍综合征。持续的氧化应激会在炎症过程中自我延续，并在目标器官中引起DNA损伤的累积[9-10]。肝组织容易受到氧化应激的影响，其耗氧量高，抗氧化防御能力适中，明显的微循环障碍和肝脏退行性改变反映了AP的病理过程[11]。本研究利用牛黄胆酸钠诱导大鼠构建AP模型。造模大鼠精神萎靡，饮食饮水减少，腹部胀大，实验过程中无大鼠死亡。经检测后发现, AP大鼠血清中AMY和炎性因子(IL-6和TNF-α)水平上调，肝脏系数显著升高，肝组织结构严重损伤，且大量炎性细胞浸润，表明AP大鼠模型构建成功。AST和ALT水平的升高是AP疾病过程的一个标志。血清中AST和ALT活性的升高，表明肝功能异常[12]。本研究发现，AP大鼠血清中ALT和AST活性明显升高，表明AP大鼠的肝脏组织受到明显损伤，肝功能出现障碍。

丁香是一种药用植物，根据其传统用法及现代药理作用，可作药用防腐剂、止痛剂和抗菌剂[13-14]。丁香叶提取物中包含20多种化合物，以丁香酚、β-石竹烯、α-腐草烯和乙酸丁二烯酯为主要成分[5]。本研究表明丁香叶提取物处理可缓解AP大鼠肝损伤，显着改善了肝脏病理变化。丁香叶提取物还抑制了AP大鼠中ALT、AST和AMY活性。这些结果表明丁香叶提取物可以改善AP大鼠的肝脏功能。氧化应激在AP相关性肝损伤的发病机制中起重要作用[15]。其他研究[16-17]表明，肝氧化应激状态的改善可以降低大鼠肝损伤进展。氧化应激抑制是改善急性胰腺炎相关性肝损伤的一种新的治疗方法。HALDER S等[18]研究发现，用丁香精油预处理可降低MDA评估的氧化应激，并降低小鼠大脑中谷胱甘肽(GSH)水平，调节小鼠氧化应激反应。本研究中，经丁香叶提取物给药的AP大鼠，血清中MDA水平下调, SOD和GSH-Px水平升高，表明丁香叶提取物可抑制AP相关肝损伤的脂质过氧化，恢复抗氧化防御系统，在治疗急性胰腺炎相关肝损伤中可能起重要作用。

PGC-1α是线粒体生物合成的中枢调节因子。PGC-1α可以通过NAD+依赖性脱乙酰基酶SIRT1催化的脱乙酰基反应而被激活[19]。NRF1在维持氧化还原和代谢动态平衡方面起重要作用。研究[20]发现,NRF1功能丧失可使细胞对氧化应激反应敏感，NRF1有助于维持正常的氧化还原动态平衡。徐洋等[21]研究发现，虾青素可通过调控SIRT1/PGC-1α/NRF1信号通路，减轻氧化应激反应，发挥对肾小管上皮细胞的保护作用。本研究中，经丁香叶提取物给药后, AP大鼠肝脏组织中SIRT1、PGC-1α、NRF1蛋白表达水平显著上调，表明丁香叶提取物可调控SIRT1/PGC-1α/NRF1信号通路，缓解AP大鼠的氧化应激反应，改善肝损伤。

综上所述，丁香叶提取物可通过调控SIRT1/PGC-1α/NRF1信号通路，减轻氧化应激反应，改善AP大鼠肝损伤。然而，丁香叶提取物抑制氧化应激的作用机制较为复杂，仍需进一步研究。