通过生物信息学分析鉴定脓毒症患者中性粒细胞中差异表达的基因、转录因子、miRNA和通路

郑煜凯 黄灿霞 李伟超 李方义 邹子俊 何志捷

脓毒症导致危及生命的器官功能障碍，这是由宿主对感染的失衡反应引起的。每年有超过1900 万脓毒症患者和500 万脓毒症相关的患者死亡［1］。中性粒细胞参与脓毒症过程，不仅是IL⁃1β和IL⁃18 的主要来源［2］，还是宿主对脓毒症的免疫反应的调节。既往研究表明中性粒细胞在脓毒症中具有关键作用。例如，诱导中性粒细胞自噬可能会增加中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的产生，减少脓毒症小鼠的死亡［3］。

在脓毒症中，高水平的miR⁃133a 与疾病的严重程度有关，而且能预测危重患者的不良结果［4］。但涉及脓毒症中性粒细胞的核心基因和miRNA 相关研究较少。生物信息学结合计算机科学和生物科学，采用通路分析、视觉化进行数据挖掘，筛选核心基因和通路。本研究旨在对脓毒症中性粒细胞的基因数据进行生物信息学分析，鉴定脓毒症中性粒细胞可能的关键基因、转录因子和miRNA。

1 临床资料

1.1 一般资料基因表达综合（GEO）数据库是PubMed 上可公开访问的基因组学数据库，包含高通量基因表达数据、微阵列数据等。以“脓毒症”或“脓毒症休克”和“中性粒细胞”为检索词，提供的检索策略如下：（“neutrophils”［MeSH Terms］OR neutrophil［All Fields］）AND（（（“sepsis”［MeSH Terms］ OR sepsis［All Fields］） OR（“shock，septic”［MeSH Terms］OR septic shock［All Fields］））OR（（“sepsis”［MeSH Terms］OR sepsis［All Fields］）AND（“shock”［MeSH Terms］OR shock［All Fields］）））。纳入标准是：（1）基因表达数据集；（2）由正常对照组和脓毒症或脓毒症休克组病例原始数据组成的数据集。排除标准是：（1）非编码RNA 和DNA 甲基化序列数据的数据集；（2）非中性粒细胞的非脓毒症数据集的样本数据。共选取3 个数据集（GSE64457、GSE123729和GSE100150）进行数据分析，2 个数据集（GSE100159 和GSE101639）作为验证。本实验已经过中山大学孙逸仙纪念医院医学伦理委员会伦理审查同意（SYSEC⁃KY⁃KS⁃2021⁃345）。

1.2 鉴定差异表达基因（DEG）R 软件中的Affy包用于读取基因表达芯片⁃CEL 格式数据，处理成表达矩阵。使用Limma 包来分析和计算脓毒症组和正常组的矩阵数据，获得差异表达基因，以火山图形式显示，结果取交集，以韦恩图显示。P＜0.05和|Log2FC|＞1 的作为阈值。

1.3 基因本体（GO）和KEGG 通路富集分析基因本体（GO）、KEGG（京都基因与基因组百科全书分析）分析用于了解生物系统的功能和通路富集情况。向DAVID 网站上传DEG，进行GO 和KEGG分析。P＜0.05 表示差异具为有统计学意义。

1.4 蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络构建和核心基因鉴定STRING 数据库为差异表达基因建立PPI 网络，使用Cytoscape 将数据可视化，其中Cyto⁃Hubba、MCODE 功能，能分析PPI 网络中基因间的度中心性、介数中心性和接近中心性的值，筛选核心基因。

1.5 转录因子（TF）-差异表达基因（DEG）配对预测及调控网络构建Cytoscape 的iRegulon 功能可以对PPI 网络分析，以归一化富集分数（NES）＞3 为标准，构建TF⁃DEG 可视化网络。使用miR⁃Walk2.0、TargetScan、Miranda、miRDB 和RNA22 数据库以预测miRNA，在Cytoscape 中可视化。

1.6 受试者工作特性曲线（ROC）分析采用R软件中的“PROC”包进行ROC 分析。计算ROC 曲线下面积（AUC），通过AUC 值评价DEG、TF 和miRNA 在脓毒症或脓毒性休克诊断中的准确性。AUC 值＞0.8 时，表明具有较好的诊断价值。

2 结 果

2.1 DEG 的鉴定DEG 以火山图的形式显示（图1.A⁃C）。如图1.D 所示，共116 个DEG，其中18 个下调DEG 和98 个上调DEG。

图1 DEG 鉴定

2.2 GO 和KEGG 分析对上调和下调的DEG 分别进行GO 和KEGG 分析。上调DEG 富集于先天免疫反应（P=1.45E⁃04）、细胞外泌体（P=1.06E⁃05）等。下调DEG 富集于淋巴细胞稳态（P=1.80E⁃02）、全膜（P=2.23E⁃02）和MAPK信号通路（P=8E⁃03）。

2.3 PPI 网络和核心基因PPI 网络共涉及116个节点和244 个互作关系（图2.A⁃B）。核心基因显示在图2.C⁃E，10 个核心基因是：AKT 1、MMP9、ARG1、MMP8、C3AR1、LCN2、QSOX1、TLR5、MAPK14 和FCAR（表1）。

图2 PPI 网络

表1 核心基因

2.4 TF-DEG 配对和调控网络ETS1 作为关键转录因子靶向39 个DEG（如AKT1）（图3）。参与TF⁃DEG 调控网络的基因进行了通路分析，包括：MAPK 信号通路（P=1.13E⁃05）、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路（P=1.02E⁃04）。鉴定出has⁃miR⁃124⁃3p 为关键的miRNA，其靶基因共9 个（7 个上调DEG 和2 个下调DEG，如RPS6KA5）差异表达。图4 显示了miRNA⁃DEG 网络。

图3 TF-DEG 调控网络

图4 miRNA-DEG 网络

2.5 ROC 分析ROC 分析结果显示，MMP9（AUC=0.955）、ETS1（AUC=0.950）、RPS6KA5（AUC=0.945）可以较好诊断脓毒症和对照样本，AKT1（AUC=0.602）诊断能力一般（图5.A）。has⁃miR⁃124⁃3p 区分脓毒性休克和对照组（AUC=0.889）或是脓毒症和对照组均具有显著的诊断价值（AUC=0.833）（图5.B⁃C），但是无法区分脓毒症和脓毒症休克组（AUC=0.556，图5.D）。

图5 ROC 分析

3 讨 论

本研究共鉴定116 个DEG，包括98 个上调和18 个下调DEG，其中AKT1 和MMP9 为核心基因，而ETS1 和has⁃miR⁃124⁃3p 是调控网络的关键因子。

AKT1 是细胞存活、代谢的调节因子。Ursula 等人［5］证明AKT1 过表达能防止脓毒症诱导的细胞凋亡。Yong H 等人［6］研究亦表明lncRNA MALAT1通过刺激AKT1 磷酸化加重脓毒症炎症反应。据报道，MMP9 可能具有抑制中性粒细胞过度迁移或抗炎的作用［7］。Reckens 发现MMP9（⁃/⁃）小鼠的感染将产生更严重的损伤［8］。我们的研究表明，AKT1、MMP9 在脓毒症中性粒细胞的MAPK 和TNF 信号通路中富集，表明AKT1、MMP9 可能是脓毒症中性粒细胞的炎症反应的关键基因。

HeH 等人研究发现炎症因子可通过TNFα→ETS1→IL⁃27ra 通路促进肝星状细胞衰老［9］。Shi⁃uYT 的研究［10］认为ETS1 参与调节细胞因子和粘附分子的表达，也是脓毒症中性粒细胞参与的重要病理生理过程。HuaP 的研究发现Ang II 诱导的ETS1磷酸化涉及ERK⁃MAPK 通路和PI3K/Akt 通路［11］。我们的研究表明脓毒症中性粒细胞中ETS1 调控的基因（如AKT1）在MAPK 和TNF 信号通路中显著富集。表明靶向AKT1 的ETS1 可能通过MAPK 和TNF通路在脓毒症中性粒细胞调控作用。

我们的研究认为has⁃miR⁃124⁃3p 是脓毒症中性粒细胞的关键miRNA，结合既往研究提示可能是通过RPS6KA5 参与脓毒症中性粒细胞的细胞凋亡过程。

综上所述，AKT1、MMP9 是脓毒症中性粒细胞的核心基因。AKT1、MMP9、靶向AKT1 的转录因子ETS1 和靶向RPS6KA5 的has⁃miR⁃124⁃3p 可能参与脓毒症中性粒细胞的重要过程，并具有较好的诊断价值。本研究结果是基于生物信息学分析的推测和假设，对于脓毒症的诊断和潜在干预指导具有显著的价值，而核心基因等在脓毒症中性粒细胞中的作用仍需要进一步的实验研究来证实。

致谢

感谢GEO 数据库的公共数据库以及在该平台分享数据的研究者，我们的研究是基于免费开放获取的数据进行的，本研究没有对人类或动物的任何实验行为。