基于数据挖掘分析ASF1B在肺腺癌中的表达及临床意义

王佶 杨峥 李海林

肺腺癌是肺癌最常见的组织学亚型，是人类因癌 症死亡的主要原因之一[1]。尽管目前肺腺癌的治疗手段较多，包括靶向治疗、免疫治疗等，但面对晚期肺腺癌，治疗结果仍难以令人满意。相较于肺鳞状细胞癌，肺腺癌主要发生在末端细支气管和肺泡内，很难用支气管镜检查[2]。因此，肺腺癌的早期阶段更加难以识别，如何尽早诊断肺腺癌就显得尤为重要。了解肺腺癌的潜在发病机制将为发现早期诊断性生物标志物提供新的见解，从而为肺腺癌患者提供个体化的治疗策略。

抗沉默功能蛋白1（anti-silencing function 1,ASF1）最初在酵母中被发现，属于组蛋白H3-H4伴侣蛋白[3]。ASF1在组蛋白的聚合、转运、修饰等过程中发挥着重要的作用[4]。ASF1有2个主要的亚型，分别是ASF1A和ASF1B[5]。已有研究显示ASF1B在乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌等肿瘤中异常表达，有望成为多种恶性肿瘤新的预后因子[6-8]。然而在肺腺癌中，ASF1B基因表达及其临床意义尚不清楚。本研究基于生物信息学分析ASF1B基因在肺腺癌中的表达及其对预后的影响，初步探索ASF1B参与肺腺癌进程的潜在分子机制。

1 材料和方法

1.1 Oncomine数据库分析 Oncomine数据库（https://www.oncomine.org/resource/login.html）的一项重要功能就是进行肿瘤组织和癌旁正常组织的基因表达差异分析。本研究设置的检索条件如下：（1）Gene：ASF1B；（2）Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；（3）Date Type：mRNA；（4）临界值设定条件（P＜0.0001，fold change 2，gene rank=Top10%）。

1.2 基因表达谱动态分析（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA2）数据库分析 GEPIA2数据库（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）是北京大学张泽民教授实验室开发的一个网站，能够对肿瘤基因图谱（the cancer genome atlas,TCGA）与基因型-组织表达（the genotype-tissue expression,GTEx）数据库共 9 736个肿瘤样本、8 587个正常样本的RNA测序（RNA sequencing,RNA-seq）表达数据进行分析。本研究使用GEPIA2数据库验证之前挖掘Oncomine数据库所得出的相关结果，然后通过“Correlation Analysis”模块分析ASF1B mRNA与肺腺癌发生关系密切的细胞周期调控因子表达的相关性，应用“Survival Plots”模块进一步分析ASF1B mRNA与肺腺癌临床分期及生存预后之间的关系。

1.3 UALCAN数据库分析 UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/）是一个有效的交互式的癌症数据挖掘工具，可以执行对TCGA基因表达数据的深入分析。本研究利用UALCAN对Oncomine和GEPIA2所得出的表达差异结果再次进行验证，并初步探索ASF1B mRNA表达水平与TP53突变的相关性。

1.4 Kaplan-Meier Plotter数据库分析 Kaplan-Meier Plotter数据库（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background）基于基因表达数据库（gene expression omnibus,GEO）、欧洲基因表型数据库（European genomephenome archive,EGA）及TCGA等公共数据库的基因芯片和RNA-seq数据构建而成，评估了54 675个基因在21种癌症中对于生存率的影响。本研究利用Kaplan-Meier Plotter数据库观察ASF1B mRNA表达与肺腺癌患者总生存率（overall survival,OS）和首次进展生存率（first progression,FP）的关系。

1.5 Linked Omics数据库分析 Linked Omics数据库（http://www.linkedomics.org/login.php）包含来自 TCGA、临床蛋白质组肿瘤分析协作组（clinical proteomic tumor analysis consortium，CPTAC）等多平台32种癌症类型的多组学数据和临床数据。本研究利用Linked Omics数据库分析ASF1B mRNA与肺腺癌患者临床资料的相关性，采用Pearson相关筛选与ASF1B具有正负相关性的共表达基因，将相关性最高的前50个基因生成在线热图。

1.6 统计学处理 采用数据库自带模块进行统计分析。肺腺癌组织与正常肺组织中ASF1B基因表达的比较采用两独立样本t检验；不同临床分期ASF1B基因表达比较采用单因素方差分析；采用Pearson相关分析ASF1B基因表达与细胞周期调控因子表达的相关性；利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析ASF1B基因与肺腺癌患者预后之间的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ASF1B mRNA在不同类型肿瘤中的表达情况 按照设置的检索条件，Oncomine数据库中共收集401项ASF1B mRNA在不同类型肿瘤组织与正常组织中表达比较的研究。ASF1B mRNA表达差异有统计学意义的研究结果共47项，其中ASF1B mRNA表达增高的研究有44项，表达降低的研究只有3项。有8项肺癌相关的研究表明ASF1B mRNA表达升高。同样，在GEPIA2数据库中检索ASF1B在常见肿瘤类型中的表达情况，结果与Oncomine数据库类似（图1，见插页）。

图1 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）mRNA在不同类型肿瘤中的表达情况[a：Oncomine数据库；b：基因表达谱动态分析（GEPIA2）数据库]

2.2 ASF1B在肺腺癌组织中的表达情况 利用Oncomine数据库进一步分析ASF1B在肺腺癌中的表达情况，其中4个数据集中，肺腺癌组织中ASF1B mRNA表达水平均高于正常肺组织（均P＜0.05）。通过GEPIA2和UALCAN数据库进一步验证，发现肺腺癌组织中ASF1B mRNA表达水平均高于正常肺组织（均P＜0.05），见图 2。

图2 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）在正常肺组织和肺腺癌组织中的表达情况[a-d：Oncomine数据库；e：UALCAN数据库；f：基因表达谱动态分析（GEPIA2）数据库；*P＜0.05]

2.3 ASF1B mRNA表达水平与肺腺癌TNM临床分期的关系 在GEPIA2数据库中分析ASF1B mRNA表达与TNM临床分期的关系，发现不同TNM临床分期的肺腺癌患者ASF1B mRNA表达水平差异有统计学意义（F=3.14，P＜0.05），见图 3。

图3 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）表达水平与肺腺癌TNM临床分期的关系

2.4 ASF1B mRNA表达水平与肺腺癌TP53突变的相关性 通过UALCAN数据库发现，正常肺组织中ASF1B mRNA表达水平均低于肺腺癌TP53突变组和无突变组（均P＜0.05），且肺腺癌TP53无突变组ASF1B mRNA表达水平低于突变组（P＜0.05），见图4。

图4 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）mRNA表达水平与肺腺癌TP53突变的相关性（*P＜0.05）

2.5 肺腺癌ASF1B mRNA表达水平与细胞周期调控因子表达的相关性分析 应用GEPIA2数据库中相关性分析功能，对肺腺癌中ASF1B mRNA表达与细胞周期蛋白（Cyclins）和细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclindependent kinases，CDKs）的表达进行相关性分析，证实ASF1与上述绝大多数基因的表达呈正相关，见表1～2。

表1 肺腺癌ASF1BmRNA表达水平与Cyclins表达的相关性分析

2.6 ASF1B mRNA表达水平与肺腺癌患者预后的关系 检索Kaplan-Meier Plotter数据库发现，ASF1B低表达组肺腺癌患者OS和FP均优于ASF1B（均P＜0.05）。GEPIA2数据库也显示，ASF1B低表达组肺腺癌患者OS和无病生存期均优于ASF1B高表达组（均P＜0.05），见图5。

图5 抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）mRNA与肺腺癌患者预后的关系[a-b：Kaplan-Meier Plotter数据库；c-d：基因表达谱动态分析（GEPIA2）数据库]

2.7 肺腺癌组织中ASF1B的共表达基因分析 检索Linked Omics数据库，采用Pearson相关筛选出与ASF1B具有正负相关性的共表达基因，并将相关性最高的前50个基因生成在线热图。结果表明 CDCA5、CDCA8、RAD54L等 50个基因与ASF1B在转录水平上呈正相关（均 P＜0.05），ZBTB4、CRY2、VAMP2 等 50个基因与ASF1B在转录水平上呈负相关（均P＜0.05），初步探讨了ASF1B参与肺腺癌进程的潜在分子机制，为后续的进一步研究奠定了基础，见图6（插页）。

表2 肺腺癌ASF1B mRNA表达水平与CDKs表达的相关性

图6 肺腺癌组织中抗沉默功能蛋白1B（ASF1B）的共表达基因分析（a：正相关；b：负相关）

3 讨论

ASF1具有调节染色质功能，并已证明有助于肿瘤的发生[9]。ASF1包括ASF1A和ASF1B两个主要的亚型。其中ASF1B主要定位于细胞核内，优先参与细胞的增殖活动，可能作为潜在的肿瘤靶标参与多种恶性肿瘤的发生、发展[10]。

Liu等[7]研究发现，ASF1B在宫颈癌细胞中起癌基因的作用。ASF1B的沉默抑制了体内和体外宫颈癌细胞的生长，诱导了细胞周期停滞，并促进了细胞凋亡，而ASF1B的过表达则促进了癌细胞的增殖。其主要机制是ASF1B与CDK9形成稳定的复合物，并积极调节CDK9的稳定性。本研究同样分析了ASF1B与调控细胞周期的两个重要相关因子Cyclins和CDKs之间的关系，发现ASF1B与多数相关因子的表达呈正相关，提示ASF1B可能在肿瘤细胞增殖过程中起到重要作用，值得进一步深入探讨分析。Corpet等[6]研究表明，ASF1B在乳腺癌细胞中具有特异性增殖作用，这是ASF1A所无法比拟的。当细胞周期结束时，与 ASF1B相对应的mRNA和蛋白表达量均减少，并且ASF1B的缺失严重影响细胞增殖，导致异常的核结构和明显的异常转录特征。通过研究ASF1B表达水平与乳腺癌临床预后的关系，证明了ASF1B是乳腺癌预后新的标志物，可高度预测转移的发生。笔者通过多个数据库，发现ASF1B高表达预示着肺腺癌患者的不良预后，提示ASF1B或许同样可以作为肺腺癌患者预后的独立标志基因，后期研究需进一步扩大样本量，验证该结论。Han等[11]发现沉默ASF1B可以抑制前列腺癌细胞的增殖，并促进其凋亡和细胞周期停滞，这种抑制作用可能与PI3K/Akt信号通路失活有关。这些结果均提示ASF1B有望作为肿瘤治疗的分子靶点。

本研究首先通过Oncomine和GEPIA2数据库探索ASF1B mRNA在常见肿瘤中的表达情况，结果显示，相较于癌旁组织，在大多数肿瘤组织中ASF1B mRNA表达水平都呈现高表达状态。进一步从Oncomine数据库中筛选出4项数据集均提示ASF1B mRNA在肺腺癌中高表达。扩大GEPIA2和UALCAN数据库分析再次证实ASF1B mRNA的高表达，并且与患者的TNM临床分期相关。TP53是迄今为止发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，有报道称甚至有50%以上的肿瘤患者存在TP53基因的突变[12]。本研究通过UALCAN数据库发现肺腺癌TP53突变组ASF1B mRNA表达水平高于TP53无突变组，这一结论提示了ASF1B与TP53突变存在某种联系，这对后续的研究提供了重要的参考意义。

综上所述，ASF1B在肺腺癌组织中高表达，且与肺腺癌的进展和预后有一定相关性，通过后续深入研究，或许能够作为预测患者预后的新型分子标志物和肿瘤治疗的新靶点。本研究亦有不足之处，上述多个在线数据库研究结果仅仅是在转录水平上得出的，具有一定局限性，有待在蛋白翻译水平得到进一步验证。此外，ASF1B参与肺腺癌进程的具体作用机制尚不明确，需要深入的基础研究来阐明ASF1B的作用和调控机制，为临床肺腺癌的治疗及靶向药物的研制提供扎实的理论依据。