富血小板血浆对肩袖损伤后脂肪浸润干预作用的研究

赵晨 胡劲涛 张琼 贲定严

肩袖损伤是引起肩关节持续疼痛的主要原因，在所有人群中发生率为5%～33%，而在年龄＞60岁人群中发生率高达25%[1]。尽管有相当多的患者肩袖损伤无临床表现，但其中部分患者会逐渐出现症状。肩袖损伤后会出现相关肌肉的萎缩、纤维化和脂肪浸润等病理改变，这些肌肉中成脂指标[CCAAT增强子结合蛋白 β（CCAAT/enhancer binding protein beta,C/EBPβ）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptors γ,PPARγ）]表达水平增高，并且伴有脂肪浸润的肩袖损伤患者在手术修复后肩关节功能恢复较差，且更容易出现肩袖再撕裂[2-3]。有研究发现即使修复肩袖仍不能阻止脂肪浸润的进展，因此有效控制和治疗肩袖损伤后脂肪浸润将有利于提高肩袖手术修复的临床疗效[4]。富血小板血浆（plateletrich plasma,PRP）是血液离心后获得的血小板和各种生长因子的浓缩物，具有促进组织修复的能力[5-6]。本研究拟探讨PRP对肩袖损伤模型大鼠脂肪浸润的干预作用及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠30只，体重200～230 g，购自上海西普尔实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2018-0006，在温度（22±2）℃、湿度40%～60%、昼夜各12 h的环境中适应性饲养1周后进行实验。本研究经浙江省人民医院动物伦理委员会审批通过。

1.2 试剂 磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）、丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin,mTOR）、C/EBPβ、PPARγ抗体（英国Abcam公司）。SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒（美国MCE公司）、TRIzol试剂（美国Life Technologies公司）、RIPA裂解液（美仑生物科技有限公司）。

1.3 分组及造模 将30只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、PRP组，每组10只。3组大鼠均右侧肩关节造模，左侧为健侧。假手术组仅予以切开皮肤，暴露肩袖组织后缝合，于冈上肌多部位肌肉内注射0.9%氯化钠注射液0.5 ml，每2 d注射1次；模型组和PRP组暴露肩袖后予以切断冈上肌肌腱，然后缝合皮肤。模型组于冈上肌多部位肌肉内注射0.9%氯化钠注射液0.5 ml，每2 d注射1次；PRP组于冈上肌多部位肌肉内注射PRP 0.5 ml，每2 d注射1次。3组大鼠均干预4周。

1.4 标本收集及指标检测 所有大鼠均在造模8周后采用CO2窒息方式处死，以尖刀片分离获取冈上肌。

1.4.1 肌肉湿重比 将新鲜获取的健侧及造模侧冈上肌进行称重，肌肉湿重比=造模侧肌肉湿重/健侧肌肉湿重×100%。

1.4.2 造模侧冈上肌病理组织学观察 将冈上肌组织固定于10%甲醛溶液中，石蜡包埋后制作成2 μm厚切片，采用油红O染色观察冈上肌组织中脂肪形成情况。随机选取冈上肌中腹部5个区域，采用Image J软件计算每个区域内20根肌纤维的横截面积，取其平均值。

1.4.3 造模侧冈上肌 PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ mRNA表达水平检测 采用qRT-PCR法。取100 mg造模侧冈上肌剪碎后，加入10倍体积的TRIzol裂解液，于匀浆机充分匀浆裂解后提取总RNA，应用反转录试剂盒将 RNA反转录为cDNA。使用PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyc-eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）引物进行 qRT-PCR 检测，配置 10 μl反应体系[5 μl SYBR Master mix（2×）、0.2 μl 10 μM 上游引物、0.2 μl 10 μM下游引物、1 μl cDNA、3.6 μl ddH2O]，按热启动（95 ℃5～10 min）、变形（95 ℃ 15 s）和退火延伸（60 ℃ 30 s）40个循环、延伸（95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s）1个循环，以2-ΔΔCt法计算目标基因表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4.4 造模侧冈上肌 PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ蛋白表达水平检测 采用Western blot法。取100 mg造模侧冈上肌剪碎后，加入冈上肌组织10倍体积的RIPA裂解液，于匀浆机充分匀浆裂解后提取总蛋白，测定蛋白浓度后进行电泳转膜，以5%脱脂牛奶封闭2 h，去除封闭液加入1:1 000比例稀释的一抗（PI3K、Akt、mTOR、C/EBPβ、PPARγ、GAPDH），于 4 ℃摇床下孵育过夜，第2天去除一抗后进行二抗孵育，完成后加入ECL显影液在Tanon-5200全自动化学发光图像分析系统进行显影。

1.5 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠冈上肌肌肉湿重比比较 造模8周后，模型组、PRP组、假手术组大鼠冈上肌肌肉湿重比分别为（67.93±6.70）%、（84.03±3.45）%、（97.47±2.90）%。模型组大鼠冈上肌肌肉湿重比小于假手术组和PRP组（均P＜0.01），PRP组大鼠冈上肌肌肉湿重比大于假手术组（P＜0.05）。

2.2 3组大鼠冈上肌病理切片脂肪浸润情况和肌纤维横截面积比较 模型组大鼠冈上肌中脂滴形成较假手术组明显增多，且肌肉组织出现萎缩；PRP组冈上肌中脂滴形成数量较模型组明显减少，且肌肉组织萎缩程度也较轻，见图1（插页）。模型组、PRP组、假手术组大鼠肌纤维横截面积分别为（1 064.33±76.81）、（1 767.33±85.05）、（2 118.00±266.28）cm2。模型组大鼠肌纤维横截面积小于假手术组和PRP组（均P＜0.01），PRP组肌纤维横截面积大于假手术组（P＜0.01）。

图1 3组大鼠冈上肌组织病理检查所见[a：假手术组；b：模型组；c：富血小板血浆（PRP）组；油红O染色，×100]

2.3 3组大鼠C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表达水平比较 模型组大鼠C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表达水平均高于假手术组（均P＜0.05），提示肩袖损伤后冈上肌中脂肪分化水平升高；而PRP组大鼠C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表达水平均低于模型组（均P＜0.05），表明PRP可以起到抑制肩袖损伤后肩袖肌肉组织脂肪分化的作用，见图2和表2。

2.4 3组大鼠 PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表达水平比较 模型组大鼠PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表达水平均高于假手术组（均P＜0.05），提示肩袖损伤后冈上肌中PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活；而PRP组大鼠 PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表达水平均低于模型组（均 P＜0.05），PI3K、Akt、mTOR mRNA 及蛋白表达的趋势与成脂指标一致，提示PRP可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而抑制肩袖损伤后肩袖肌肉组织中脂肪分化，见图3和表3～4。

表3 3组大鼠PI3K、Akt、mTOR mRNA表达水平比较

图3 3组大鼠磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）mRNA及蛋白表达水平比较（a：3组大鼠 PI3K、Akt、mTOR mRNA 表达水平比较；b：3组大鼠 PI3K、Akt、mTOR蛋白表达的电泳图；c：3组大鼠 PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平比较；PRP为富血小板血浆；*P＜0.05，**P＜0.01）

3 讨论

肩袖损伤后相应肌肉的脂肪浸润是肩袖肌肉组织中出现异位脂肪的形成，尽管大量研究者们对肩袖损伤后脂肪浸润的相关机制进行了探索，但其具体的作用机制仍未被阐明。目前认为年龄、肌肉损伤、机械失负荷、激素失衡等是引起肌肉组织中异位脂肪形成的重要原因，肌肉组织中的多能干细胞或前体细胞在脂肪形成信号通路激活后向脂肪细胞分化是其潜在的分子机制[7-8]。

表4 3组大鼠PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平比较

RP是自体血在离心后获得的血小板浓缩血浆，血小板是由巨核细胞释放的无核细胞碎片，包含各种生长因子、细胞因子、ATP、钙离子、5-羟色胺、多巴胺等多种物质，对维持组织稳态具有重要作用，在临床上PRP已被广泛应用于治疗各种软组织疾患[9-10]。Fitzpatrick等[11]应用PRP治疗慢性臀肌腱病，结果显示PRP能明显减轻患者的疼痛症状，改善臀部肌肉功能。一项关于PRP治疗肩袖相关疾病的Meta分析表明，PRP能提高患者短期和长期的肩关节功能，而且还可以减少肩袖损伤修复后再撕裂的发生[12]。PRP对组织稳态的维持和修复能力很可能与其能够调节相关细胞的分化，从而维持组织完整结构有关。Liao等[13]应用不同浓度的PRP干预脂肪干细胞，发现PRP能够显著促进脂肪干细胞的增殖能力，同时抑制了脂肪干细胞向成脂的分化。另一项研究观察了不同PRP浓度对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）分化的影响，结果显示PRP血小板浓度＞1 500×109pl/L可以显著增加MSCs的增殖，低血小板浓度仅有轻微促进MSCs成脂分化的作用，而在血小板浓度＞1 800×109pl/L时促进成脂分化的作用显著，血小板浓度在（200～3 000）×109pl/L可以促进MSCs向成骨分化，（1 000～3 000）×109pl/L能够促进MSCs向成软骨分化[14]。因此，PRP很可能通过调节肩袖肌肉组织中细胞的分化起到预防肩袖损伤后脂肪浸润发生的作用。本研究应用PRP干预肩袖损伤模型大鼠的冈上肌，发现PRP治疗后大鼠冈上肌中脂滴的形成明显减少，模型组中反映脂肪形成指标的C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表达水平均高于假手术组，而PRP干预过的冈上肌中C/EBPβ、PPARγ mRNA及蛋白表达水平相比模型组有明显下降，这表明PRP能够有效阻止肩袖损伤后脂肪浸润的发生。Takase等[15]的研究结果与本研究结果相似，他们同时进行了体内和体外研究，体外研究显示PRP促进了C2C12细胞（小鼠成肌细胞）的增殖，而抑制了其成脂分化潜能；体内研究显示PRP明显减少了肩袖肌肉组织中脂滴的形成，组织内成脂相关基因被抑制。

PI3K/Akt/mTOR信号通路作为细胞内重要的信号通路之一，通过调节下游相关靶蛋白的活化状态，调控细胞的增殖、分化及蛋白质合成，其在脂肪形成过程中具有重要意义[16-17]。Joshi等[18]发现PI3K/Akt/mTOR信号通路可以通过调控转录因子PPAR调节肩袖组织内脂肪浸润的发生，而PPAR和C/EBPβ参与了MSCs分化为脂肪前期细胞的过程。本研究结果发现肩袖损伤模型大鼠冈上肌中PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表达水平较假手术组升高，这表明肩袖损伤会激活肩袖肌肉组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而促进肩袖肌肉组织内脂肪的形成；而在PRP干预后，PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白表达水平较模型组明显降低，冈上肌中脂肪的形成也相应减少，这表明PRP能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，减少肩袖肌肉组织内脂肪分化。

综上所述，本研究结果表明PRP能够通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，减少肩袖损伤后脂肪浸润的发生。