miRNA在哮喘儿童支气管肺泡灌洗液细胞中的表达和作用研究

刘敏 唐兰芳

哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病，主要表现为可逆性气流阻塞、支气管高反应性和慢性炎症，在世界范围内具有较高的发病率和死亡率[1-2]。目前已知哮喘是由环境因素和遗传因素间相互作用所引起的，但其发病机制尚未完全阐明。近年来越来越多的证据表明，表观遗传调控在哮喘发病中起重要作用[3-4]。

miRNA是一组进化上高度保守的长度约19～22个核苷酸的单链非编码 RNA。每个miRNA通过沉默靶mRNA来调节数百个编码和非编码基因。目前已有部分miRNA被报道可能通过调节细胞增殖、分化及黏膜纤毛功能受损等参与哮喘的发病机制[2，5]，但研究标本大多来自动物哮喘模型、成人肺组织或者哮喘儿童血清等。由于哮喘儿童肺组织难以获得，而支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）是反映肺组织的最佳标志物。本研究利用miRNA芯片分析哮喘儿童BALF细胞中miRNA水平，通过qRT-PCR对差异表达的miRNA进行验证，并对可能的靶基因的表达水平进行检测，从而探讨miRNA参与儿童哮喘发病中可能的作用机制。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年1月至2017年2月在浙江大学医学院附属儿童医院呼吸内科住院的哮喘患儿15例为哮喘组，哮喘诊断标准参照2016年中华医学会儿科学分会呼吸学组《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016年版）》[6]。所有患儿均接受过糖皮质激素治疗，近期无好转或病情进展，排除其他肺部疾病、免疫疾病及心血管系统疾病或BALF不合格患儿。选取同期本院确诊为支气管异物的12例患儿为对照组，异物均在24 h内经纤维支气管镜取出，排除右肺中叶异物、其他肺部疾病、免疫疾病、心血管系统疾病及过敏性疾病或BALF不合格患儿。因样本数量限制，取哮喘组5例、对照组4例患儿的BALF细胞用于miRNA芯片检测；再取哮喘组5例、对照组3例患儿的BALF细胞用于验证miR-34/449家族；最后取哮喘组和对照组各5例患儿的BALF细胞用于验证miR-200家族和E-钙黏蛋白（E-cadherin）基因。E-cadherin蛋白表达水平测定所用标本为以上用于验证miR-34/449家族和miR-200家族表达的所有患儿BALF细胞的上清液。两组患儿在不同检测过程中性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。本实验获得所有患儿家长或监护人的同意，并经本院医学伦理委员会审批通过（浙儿伦申2015-HP-037）。

表1 不同检测组患儿性别及年龄的比较

1.2 BALF收集 首先选定灌洗部位为右肺段中叶，所有患儿行纤维支气管镜操作前15～30 min静脉注射马来酸咪达唑仑（0.3 mg/kg）进行全身麻醉，达到适当的麻醉深度后，纤维支气管镜经鼻腔或口腔轻柔进入，到达声门前及气管处分别通过细硅胶管滴注2%利多卡因进行局部麻醉，进入至右肺中叶后，快速注入37℃0.9%氯化钠溶液进行肺泡灌洗（每次1 ml/kg，单次最大量为20 ml，共3次），结束后以25～100 mmHg（-3.3～-13.3 kPa）负压吸引回收，装入塑料容器内。标本均在4℃，300 g条件下离心10 min，分别收集BALF细胞、上清液用于进一步研究，其中细胞用于RNA提取，上清液用于ELISA蛋白检测。BALF合格标准为：（1）达到规定的回收量，即回收量大于总灌注量的40%；（2）红细胞数不超过灌洗液细胞总数的10%；（3）上皮细胞数应小于灌洗液细胞总数的3%。经检测入组对象的BALF均符合标准。

1.3 miRNA芯片检测 使用QIAGEN RNeasy微量试剂盒（德国凯杰公司）从BALF细胞中提取总RNA，使用AffymetrixGeneChip miRNA 4.0阵列（美国昂飞公司）对miRNA进行检测。使用FlashTagBiotin HSR RNA标记试剂盒（美国昂飞公司），通过Poly(A)聚合酶标记来自细胞的1 μg总RNA。按照使用建议，将 RNA与 AffymetrixGeneChip miRNA 4.0阵列杂交。使用GeneChip2杂交、洗涤和染色试剂盒（美国昂飞公司）和 GeneChip2 Scanner 3000 7G进行染色、洗涤和扫描。使用 Affymetrix Command Console软件进行特征提取。原始数据按以下顺序处理：背景检测、RMA全局背景相关性、分位数归一化、中值估计和使用 miRNA QC软件工具（美国昂飞公司）进行 log2转换。

1.4 差异表达miRNA的验证及靶基因的表达测定 采用qRT-PCR法检测miRNA芯片检测到的miR-34/449家族的6个miRNA和miR-200家族的7个miRNA的表达，以验证是否与基因芯片结果一致，同时用以检测靶基因E-cadherin的表达。用Trizol试剂（美国英杰生命技术有限公司）提取总RNA。使用NanoDrop Lite分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）测量 RNA浓度。miRNA qRT-PCR使用miDETECT A TrackTMmiRNA qRT-PCR Starter Ki（t广州锐博生物科技有限公司）。对于目标基因E-cadherin的表达，使用GoScriptTM Reverse Transcription System获得 cDNA，通过GoTaqqPCR Master Mix试剂盒（美国普洛麦格公司）对目标基因表达进行验证。数据使用2-ΔΔCt法进行分析。U6和GAPDH分别作为miRNA和E-cadherin表达的内参。miRNA的反向引物序列及内参U6引物序列均由锐博公司设计并合成，所有引物序列见表2。

表2 引物序列

1.5 目标基因分析和验证 通过miRBase数据库（http://www.mirbase.org/）、miRTarBase数据库（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）和查阅文献等选取miRNA-34/449和miRNA-200家族的靶基因E-cadherin，通过上述qRT-PCR法检测E-cadherin基因的表达水平。使用BCA蛋白检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）测量 BALF上清液中的总蛋白量，使用人E-cadherin Quantikine ELISA试剂盒（美国R&D生物有限公司）测量E-cadherin的蛋白水平，其中E-cadherin蛋白与总蛋白的比值（E-cadherin/总蛋白蛋白比值）用于估计E-cadherin蛋白表达水平。

1.6 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件和Graph-Pad Prism 6.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。计数资料组间比较采用Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿中存在差异性表达的miRNA比较 两组患儿存在65个差异表达的miRNA（图1，见插页）。哮喘组有22个miRNA比对照组增加了2倍或更多，显著上调的 miRNA为 miR-143-3p、miR-424-3p、miR-199a-3p 和 miR-199b-3p，分别增加了 3.71、3.58、3.46 和3.46倍；其他上调的miRNA包括miR-3197、miR-4484、miR-503-5p、miR-1290、miR-1304-5p、miR-6126、miR-212-3p、miR-7515、miR-3135b、miR-6780b-5p、miR-4430、miR-6772-5p、miR-4417、miR-4485、miR-204-3p、miR-4533、miR-1183 和 miR-6758-5p，见表3。另外，哮喘组有43个miRNA呈低表达水平。miR-34/449家族的3个miRNA，包括 miR-34b-5p、miR-34b-3p和miR-34c-5p均显著下调，仅为对照组的0.07、0.08和0.09倍。其他下调的miRNA包括miR-34/449家族的其他成员（如 miR-34c-3p、miR-449a）、miR-200 家族（miR-200a/b/c、miR-429 和 miR-141）、miR-23b/27b簇（miR-23b、miR-27b）、miR-92b、miR-100等。6个miR-34/449 家族的 miRNA（miR-34b-5p、miR-34b-3p、miR-34c-5p、miR-34c-3p、miR-449a和 miR-449b-5p）和 7 个miR-200 家族的 miRNA（miR-200a-3p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-200b-5p、miR-200c-3p、miR-429和miR-141-3p）减少，占哮喘儿童BALF细胞下调miRNA的 30.2%（13/43），见表 4。

表3 BALF细胞中22个表达上调的miRNA

表4 BALF细胞中43个表达下调的miRNA

图1 两组患儿中存在的65个差异表达的miRNA

2.2 差异表达miRNA验证 由于miR-34/449家族的6个miRNA和miR-200家族的7个miRNA占所有下调miRNA的很大比例，因此本研究选取了这两个miRNA家族进行验证。miR-34/449家族验证显示哮喘组患儿 miR-34b-5p、miR-34b-3p、miR-34c-5p、miR-34c-3p表达水平均低于对照组（均P＜0.05），而两组患儿miR-449a和miR-449b-5p表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图2。miR-200家族验证显示哮喘组患儿miR-200a-5p、miR-200a-3p、miR-200b-5p、miR-200b-3p、miR-200c-3p 和 miR-141-3p表达水平低于对照组（P＜0.05），而两组患儿miR-429比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图2 miR-34/449家族验证结果（*P＜0.05，**P＜0.01）

图3 miR-200家族验证结果（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 两组患儿E-cadherin基因及蛋白表达水平比较 哮喘组患儿E-cadherin基因表达水平低于对照组（P＜0.05）。哮喘组患儿E-cadherin/总蛋白蛋白比值为（0.001 6±0.000 4）%，低于对照组的（0.003 5±0.000 7）%，差异有统计学意义（P＜0.05），提示哮喘组患儿E-cadherin蛋白表达水平低于对照组，见图4。

图4 E-钙黏蛋白（E-cadherin）验证结果（*P＜0.05）

3 讨论

哮喘是一种复杂的异质性疾病，以炎症细胞（嗜酸性粒细胞、Th、巨噬细胞等）、活化结构细胞（支气管上皮细胞、气道平滑肌细胞）为主要效应细胞，参与哮喘中的免疫应答及气道重塑。越来越多的研究表明，miRNA可通过调控炎症细胞、气道上皮或成纤维细胞的比例和功能变化在哮喘的发病中发挥重要作用[7-9]。但是对于miRNA与儿童哮喘关系的研究大多通过血液、痰液或者哮喘动物模型来实现，直接通过患儿BALF来进行的研究较少。因此相较于血液、痰液等，BALF检测miRNA可以更准确、直接地反映儿童哮喘肺部病理变化。

本研究发现在哮喘组与对照组患儿间存在miRNA的差异表达，提示miRNA参与了哮喘的发病机制，而差异表达的miRNA与之前的报道略有不同[10-11]，可能与样本来源、疾病阶段或严重程度有关，因此需要进一步研究这些差异表达miRNA的细胞来源、特定表达机制和实际功能。尽管哮喘组中存在22个上调miRNA，且miR-143-3p在哮喘组呈高表达水平，但笔者发现哮喘中呈低表达miRNA约占总体的2/3（43/65），因此推测哮喘中miRNA大多为表达下调。

已知一个miRNA家族中的miRNA通常具有相似的miRNA序列，可能调控相似基因并发挥相似的作用。本研究发现miR-34家族的6个miRNA和miR-200家族的7个miRNA在哮喘儿童中表达下调，并通过qRT-PCR验证了miR-34/449家族的4个miRNA和miR-200家族的6个在哮喘儿童中呈低表达水平。已知转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）受体介导的信号通路可通过调节气道慢性炎症、气道高反应性及气道重塑等过程，在哮喘中发挥重要作用[12-13]。基于肿瘤研究指出，miR-34/449家族和miR-200家族可与TGF-β形成复杂的反馈环，包括SNAIL 同源物 1（snail homolog 1,SNAI1）/miR-34双重负反馈环和锌指E-盒结合同源异形盒（zinc-finger E-box binding homeobox,ZEB）/miR-200双重负反馈环，且SNAI1和ZEB1/2的表达对E-cadherin均表现为抑制作用[14]。本研究通过生物信息数据库预测E-cadherin是两个家族的靶基因，并在基因和蛋白表达水平进行验证，发现哮喘患儿E-cadherin表达下降。E-cadherin是维持上皮完整性和通过释放生长因子和促炎因子介导气道上皮免疫功能的重要黏附分子，其丢失和重新分布可能促进上皮细胞的炎症活动，在哮喘的发病机制中起重要作用[15]。因此miR-34家族和miR-200家族可能通过调控E-cadherin的表达参与哮喘的发病机制，为哮喘的防治提供新靶点。此外根据相关文献，预测两种miRNA家族参与哮喘的信号通路可能为TGF-β受体介导的信号通路。

本研究存在以下局限：首先，对照组实际上并不是正常的儿童，虽然本研究选择了24 h内去除异物的患儿，但BALF细胞可能与正常儿童的BALF细胞存在一些差异。其次，由于样本量较少，BALF中的细胞有限，用于miRNA芯片、qRT-PCR和 ELISA的样本来自不同的患儿，并不是一一对应。最后，miRNA与靶基因之间的关系没有通过进一步的实验（基因敲除、免疫组化等实验）来验证。因此对于哮喘中具体的miRNA调控机制的认识需要更进一步、更深入的研究来明确。