PCR-毛细电泳片段分析法检测毛细支气管炎病原的临床价值探讨

季妙玉 吕佳美 李海燕 陈小芳 温顺航 张海邻 钱燕巧 董琳

毛细支气管炎是婴幼儿常见的下呼吸道疾病，严重影响婴幼儿的身体健康。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）是毛细支气管炎最常见的病原，约占 50%～80%[1]。鼻病毒（rhinovirus,RV）是毛细支气管炎的第二大病原，约占20%～40%[2]。其他能引起毛细支气管炎的病原包括偏肺病毒（human metapneumovirus,HMPV）、博卡病毒（human boca virus,HBoV）、副流感病毒（human parainfluenza virus,HPIV）、流感病毒（influenza virus,Flu）、腺病毒（adenovirus,ADV）等。不同病原对毛细支气管炎患儿的远期呼吸道结局的影响程度也有所差别，因此，明确毛细支气管炎的病原显得尤为重要。

目前，检测呼吸道病毒的方法多种多样。病毒培养仍是金标准，但是由于其耗时长、费用高且专业要求高，临床应用并不广泛。直接免疫荧光法（direct immunofluorescence assay,DFA）具有低成本、高效率等优点，但其病毒检测种类有限。相较于DFA，PCR具有病毒检测种类多、灵敏度和特异度高等优点[3]。本研究分别采用PCR-毛细电泳片段分析法（PCR-capillary electrophoresis fragment analysis,PCR-CEFA）和 DFA检测毛细支气管炎患儿的呼吸道病毒，从而了解PCRCEFA与DFA在病毒检出率、检测灵敏度及特异度上的差异，并探讨PCR-CEFA检测毛细支气管炎病原的临床应用价值。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年1至12月温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院儿科收治的因毛细支气管炎住院的≤24个月且喘息次数≤2次的患儿932例，其中男702例，女230例；年龄1～24个月，中位年龄6个月，≤12月龄790例，＞12～24月龄142例。纳入标准：（1）临床诊断为毛细支气管炎，诊断标准参考《诸福棠实用儿科学》第8版[4]；（2）喘息次数≤2次。排除标准：（1）患慢性心肺疾病（先天性心脏病、支气管炎肺发育不良、肺纤维化等）、先天性呼吸道畸形、早产、双胎、免疫缺陷等基础疾病者；（2）临床资料不全者。本研究经温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院医学伦理委员会审批通过，所有患儿家属均签署知情同意书。

1.2 呼吸道标本采集及处理 患儿入院24 h内取鼻咽分泌物1～2 ml，置于2 ml 0.9%氯化钠溶液中待检，用漩涡混合器打散鼻咽分泌物黏液后，1 500 r/min离心10 min，沉淀物用pH 7.2的PBS 8～10 ml洗涤2次，再用少量PBS调成悬液呈淡云雾状，制片，用于DFA检测。采用TANBeadOptiPure Viral Auto Tube（中国台湾圆点奈米技术股份有限公司，型号：SLA-32）对鼻咽分泌物标本进行自动磁珠提取，提取核酸后置于PCR管中保存。

1.3 DFA检测病毒抗原 吸管吸取细胞悬液点于带孔玻片，干燥后冷丙酮固定10 min。采用荧光标记的呼吸道病毒单克隆抗体分别检测RSV、ADV、Flu A、B型、HPIV 1-4型病毒抗原，具体过程按试剂说明书操作，结果判断以见到≥2个完整细胞内有明亮黄绿色荧光为阳性，否则为阴性。

1.4 PCR-CEFA检测病毒核酸 （1）病原检测：检测病毒包括 RSV、RV、ADV、Flu A、B 型、HPIV 1-4 型、HBoV、HMPV、冠状病毒（coronavirus,COV）。（2）引物设计：根据NCBI上公布的病原体目的序列，进行Blast比对分析，找到各个病毒的相对保守的区域并设计引物，将所有检测靶点的反向和正向引物分别混合为反转录引物混合液（RT primer mix）和PCR引物混合液（PCR primer mix）。（3）多重 PCR扩增：按说明书在PCR管内加入试剂（宁波海尔施基因科技有限公司，批号：180111004、190325003、190514002）和样品以进行目的片段的反转录步骤，混匀后按以下温度孵育：48℃1 min、42℃ 60 min、95℃ 5 min，然后4℃保存。之后按比例在新PCR管内加入试剂和样品以进行目的片段的PCR步骤，混合后按以下温度进行热循环反应：94℃1 min、94 ℃ 30 min、60 ℃ 30 min、70 ℃ 1 min，上述步骤重复35次，70℃ 1 min，然后4℃保存。（4）毛细电泳片段分析：配制下述毛细电泳体系：上样液38.5 μl+DNA 内标 0.5 μl+PCR 产物 1 μl，合计 40 μl，将约220 μl分离液加入96孔分离液板上对应的孔中。用遗传分析仪（美国Thermo Fisher公司，型号：ABI 3500Dx）对各种样品的PCR扩增产物进行毛细电泳片段分析。具体检测由宁波海尔施基因科技有限公司完成。

1.5 流行病学资料收集和分组比较 收集患儿性别、年龄、既往喘息史、湿疹史、哮喘家族史、家族过敏性疾病史、总IgE、血嗜酸性粒细胞计数（blood eosinophil count,B-Eos）等资料。对于流行病学资料不全的患儿进行电话询问，部分患儿因停机、空号等原因在后续流行病学资料比较时予以剔除。比较RSV组与RV组患儿流行病学资料及实验室检查结果。

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。一致性检验采用Kappa检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR-CEFA和DFA病毒检出率比较 经PCRCEFA检测，有822例患儿至少检测出1种病毒，共检出981株病毒，病毒检出率为88.2%（822/932）。以RV和RSV检出率较高，分别为35.7%和34.2%。病毒混合感染150例（16.1%），其中两种病毒混合感染141例，以RSV合并RV感染为主，占34.0%（48/141）；3种病毒混合感染9例，占6.0%（9/150）。经DFA检测，有313例患儿至少检测出1种病毒感染，共检出318株病毒，病毒检出率为33.6%（313/932）。以RSV检出率最高，占26.5%。病毒混合感染5例，占1.6%（5/313），均为两种病毒混合感染。PCR-CEFA病毒检出率高于DFA病毒检出率，差异有统计学意义（χ2=583.658，P＜0.01）。PCR-CEFA 对 RSV、HPIV、Flu、ADV 的检出率均高于DFA，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表1。

表1 PCR-CEFA和DFA病毒检出率比较[例（%）]

2.2 PCR-CEFA和DFA对呼吸道病毒检测效能的比较 以DFA为参照，对PCR-CEFA检测RSV、HPIV、Flu、ADV的效能进行分析，发现相较于DFA，R-CEFA检测RSV、HPIV、Flu、ADV的特异度均达80%以上，见表2。此外，在932例毛细支气管炎患儿中，DFA共检出 RSV、HPIV、Flu、ADV 4种病毒，选择与之相同病毒的PCR-CEFA检测结果进行Kappa检验，两者一致性较好（Kappa=0.459，P＜0.05），见表 3。

表2 PCR-CEFA和DFA对呼吸道病毒检测效能的比较

表3 PCR-CEFA和DFA检测4种呼吸道病毒的一致性比较

2.3 不同年龄组患儿病毒检出率比较 ≤12月龄患儿 RSV检出率高于＞12～24月龄患儿，RV、ADV、HBoV检出率均低于＞12～24月龄患儿，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；但不同年龄组患儿HPIV、HMPV、Flu、COV检出率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 4。

表4 不同年龄组患儿病毒检出率比较[例（%）]

2.4 RSV组与RV组患儿流行病学资料及实验室检查结果比较 收集RSV、RV阳性患儿的临床资料，剔除其中流行病学资料不齐全者，共纳入582例患儿，其中RSV组284例，RV组298例。RV组患儿年龄、B-Eos升高比例均明显高于RSV组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；而两组患儿性别、既往喘息史、湿疹史、哮喘家族史、家族过敏性疾病史、总IgE升高比例比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表5。其余病毒例数较少，未予分析。

表5 RSV组与RV组流行病学资料及实验室检查结果比较

3 讨论

毛细支气管炎是1岁以下婴儿住院最常见的疾病。能引发毛细支气管炎的病毒多种多样，准确地检测病原体有利于指导治疗、减少传播和降低住院成本，而一种能涵盖多种病毒且检测阳性率高的检测方法在此时显得尤为重要。本研究采用PCR-CEFA和DFA对932例毛细支气管炎患儿的鼻咽分泌物进行呼吸道病毒检测，结果显示PCR-CEFA病毒检出率明显高于DFA。此外，本研究中，PCR-CEFA对于混合感染的检出率亦高于DFA。其中以RSV合并RV感染最为多见，这与Tran等[5]的研究结果相一致。

RSV是引起婴幼儿毛细支气管炎的最常见病毒，本研究中PCR-CEFA对RSV的检出率明显高于DFA。PCR-CEFA对RSV的检出率更接近于孙亚林等[6]的研究，但稍低于Jain等[1]的研究。此外，在本研究中，以DFA为参照，PCR-CEFA表现出良好的特异度，这意味着采用PCR-CEFA可以较大程度地减少对RSV感染患儿的误诊，从而更有利于明确感染病原、指导后续治疗。

ADV在≤3岁婴幼儿中感染风险更高[7]。ADV感染在对肺部造成损害的同时，也会对其他器官、系统造成损伤，从而引起较高的病死率。因此，一种更高效的检测方法亟待应用。本研究发现，尽管DFA能够对ADV进行检测，但其检出率较低，DFA在932份样本中仅发现5例感染者，而PCR-CEFA则检出36例感染者，显然，PCR-CEFA对ADV的检测优于DFA。

由于RV的血清型多且缺乏常见的群抗原，导致利用DFA检测RV抗原变得困难。近年来，随着PCR技术的应用，人们对于RV的研究逐渐增多。研究显示RV是仅次于RSV的能引发毛细支气管炎的病毒[2]。但也有部分研究发现在毛细支气管炎患儿中RV占比较高，甚至高于RSV[8]。本研究中，经PCR-CEFA检测后亦发现，RV的检出率略高于RSV，这可能与样本量及流行年份有关。随着对RV认识的不断增加，不难发现，RV是引发毛细支气管炎的重要病毒，需引起广大临床医生的重视。

HMPV、HBoV、COV亦可引发毛细支气管炎。大量研究显示，HMPV、HBoV、COV感染所致毛细支气管炎与其后反复喘息，甚至哮喘的发生息息相关[9-11]。因此，对于HMPV、HBoV、COV的研究不容忽视。PCR-CEFA能检测DFA所不能检测的病毒（包括RV、HMPV、HBoV、COV），有利于今后对相关病毒及其亚型开展进一步研究，了解其临床表现及临床结局的异同。

本研究中，经PCR-CEFA检测发现，RSV、RV是毛细支气管炎的主要病原体。因此，笔者对RSV、RV感染患儿的流行病学资料及实验室检查结果进行了分析。芬兰的一项研究发现，RSV是12月龄以下毛细支气管炎患儿中最常见的病原体，而RV则在12～24月龄患儿中更为突出[12]。本研究亦发现，RSV、RV存在年龄分布差异，RSV主要见于≤12月龄患儿，RV主要见于＞12～24月龄患儿。本研究中ADV、HBoV亦存在年龄分布差异，但由于总例数较少，仍需加大样本量以明确其是否存在年龄分布规律。有研究发现，RV毛细支气管炎患儿B-Eos和总IgE常增高[12]，过敏、湿疹是毛细支气管炎患儿反复喘息、学龄期儿童过敏性哮喘的危险因素[13]。本研究中，RV组患儿B-Eos升高比例高于RSV组，但两组患儿湿疹史、总IgE比较差异均无统计学意义。目前关于RV和RSV与过敏性疾病的关系尚无定论，仍有待进一步研究证实。

综上所述，RV、RSV是毛细支气管炎的主要病原体，RSV感染主要见于≤12月龄患儿，而RV感染主要见于＞12～24月龄患儿；相较于RSV感染患儿，RV感染患儿更有可能出现B-Eos的升高。尽管PCRCEFA价格相对较高，但其具有检测阳性率高、检测病毒种类多且特异度良好的优势，可早期明确毛细支气管炎的感染病原，从而为毛细支气管炎后反复喘息乃至哮喘的早期预防和治疗提供依据。