白芍总苷调控 NF-κB/TGF-β1/Smad信号通路对慢性盆腔炎大鼠子宫组织的影响

于辉 陈辉

慢性盆腔炎是女性上生殖道感染性疾病，表现为子宫、阴道及周围结缔组织炎症，具有迁延难愈、反复发作的特点，甚至可引发慢性盆腔痛、异位妊娠、不孕等[1-2]。目前，临床上对于慢性盆腔炎主要采取抗菌药物、激素等药物治疗或物理疗法，但疗效并不理想，并且长时间应用抗菌药物易导致细菌耐药、多重感染等诸多弊端，增加治疗难度[3]。

NF-κB/转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smad 信号通路在机体炎症反应过程中发挥着重要的调控作用[4]。传统中药白芍为毛茛科植物芍药的干燥根，具有养血调经、柔肝止痛的功效，常用于月经不调、盗汗、腹痛等症的治疗。白芍总苷（total glucosides of paeony,TGP）是中药白芍的主要活性成分，具有良好的抗炎活性[5]。有研究发现，TGP对NF-κB/TGF-β1/Smad信号通路具有调控作用[6]。本实验通过制备慢性盆腔炎大鼠模型，以妇科千金片为阳性对照药物，探讨TGP对慢性盆腔炎大鼠子宫的保护作用及其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级健康成年雌性未孕SD大鼠120只，体质量200～240 g，购自河北医科大学实验动物学部，动物生产许可证号：SCXK（冀）2018-004。分笼饲养于河北工程大学医学部实验动物中心，室温25℃，相对湿度55%～65%，12 h光照黑暗交替，自由饮水进食，无菌通风，适应性饲养7 d后开展实验。

1.2 实验药物、试剂与仪器 TGP胶囊（批号：20191124）购自宁波立华制药有限公司；妇科千金片（批号：B190030407）购自株洲千金药业股份有限公司；HE染色试剂盒（批号：200115）购自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-1β、IL-10 ELISA 试剂盒（批号：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0006）购自北京索莱宝科技有限公司；NF-κB、TGF-β1、Smad 同源物 2（Smad2）、Smad同源物 3（Smad3）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体和IgG 二抗（批号：bs-23217R、bs-0086R、bs-0718R、bs-3484R、bs-0061R、bs-0295G）购自北京博奥森生物科技有限公司；3×1010混合细菌悬液（链球菌∶大肠埃希菌∶金黄色葡萄糖球菌以1∶2∶1比例混合）由河北医科大学生化教研室提供；RM2016型组织切片机购自上海徕卡仪器有限公司；BMJ-Ⅲ型包埋机购自常州郊区中威电子仪器厂；Spectra Max3型多功能酶标仪购自美国Molecuar Devices公司；VE180型小型高通量电泳槽购自上海天能科技有限公司；SE300型电泳仪、TE22型转膜仪购自美国Hoefer公司；DHG-9140A型烘烤箱购自上海慧泰仪器制造有限公司；X-70型光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组、模型制备与给药 采用随机数字表法将120只大鼠分为假手术组、模型组、妇科千金片组（150 mg/kg）[7]和 TGP 低、中、高剂量组（20、40、80 mg/kg）6组，每组20只。参照秦翠梅等[8]报道的方法制备慢性盆腔炎大鼠模型：实施麻醉后仰卧位固定，沿下腹部中线切口（长度约1 cm），暴露子宫，用1 ml无菌注射器针头于子宫分叉处刺入子宫，连续来回抽推针头3次造成机械损伤，然后以0.2 ml剂量注入混合细菌悬液，然后逐层缝合，碘伏消毒；假手术组大鼠仅子宫注射0.2 ml 0.9%氯化钠注射液（不来回抽推针头，不造成机械损伤）。造模10 d后，TGP低、中、高剂量组分别给予浓度 4、8、16 g/L 的 TGP 溶液（5 ml/kg）灌胃，妇科千金片组给予浓度30 g/L的妇科千金片溶液（5 ml/kg）灌胃，假手术组和模型组给予0.9%氯化钠溶液（5 ml/kg）灌胃，各组均1次/d、疗程21 d。

1.3.2 子宫大体情况观察及子宫粘连评分 末次给药24 h后，各组分别随机取10只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死，开腹取子宫组织，观察子宫大体情况。通过Verco评分评价子宫粘连状况[9]：无粘连计0分；轻微膜状粘连计1分；子宫角与肠管或膀胱粘连，根据粘连致密程度计2～3分；严重粘连、子宫固定不动计4分。

1.3.3 子宫系数计算 大鼠称重后摘取子宫组织，0.9%氯化钠溶液冲洗干净后称量子宫重量，子宫系数=子宫重量/大鼠体重。

1.3.4 子宫组织病理学检查及病理评分 将子宫组织置4%多聚甲醛溶液固定3 d，经石蜡浸润包埋、切片（厚度4 μm）、透明和脱蜡水化后行常规HE染色，中性树胶封片后通过光学显微镜观察子宫组织病理学变化。分别从宫腔扩张或粘连、上皮变性坏死、慢性炎症浸润、内膜充血水肿和上皮细胞增生5个方面进行病理评分[10]，根据病变程度分别计0～3分。

1.3.5 血清炎症因子水平检测 末次给药24 h后，分别取各组剩余10只大鼠，麻醉后开腹，经腹主动脉取血，3 500 r/min离心5 min后取血清，遵照ELISA试剂盒操作方法，通过酶标仪检测血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平。

1.3.6 子宫组织 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表达水平检测 采用Western blot法。“1.3.5”步骤取血完成后，颈椎脱臼处死大鼠，取每只大鼠子宫组织100 mg，0.9%氯化钠溶液冲洗后加入适量4℃冷裂解液，冰上静置30 min，通过蛋白提取试剂盒提取子宫组织总蛋白，12 000 r/min离心15 min后取上清液，BCA法检测总蛋白含量，100℃变性10 min，90 V恒压电泳分离蛋白后300 mA恒流将蛋白转至PVDF膜，8%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，滴加目标蛋白NF-κB（1∶800）、TGF-β1（1∶800）、Smad2（1 ∶1 000）、Smad3（1∶1 000）和 β-actin（1∶2 000）一抗后 4 ℃孵育过夜，洗膜后滴加 IgG二抗（1∶3 000）后室温孵育2 h，滴加ECL显影后，通过Image J软件分析条带的灰度值，然后以β-actin为内参计算目标蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。采用Shapiro-Wilk检验对数据进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以表示，方差齐时，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；方差不齐时，多组间比较采用 Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Mann-Whitney U检验。不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用 Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Mann-Whitney U检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠子宫大体状况观察及子宫粘连评分比较 假手术组大鼠子宫颜色正常，未见充血水肿及周围组织粘连；模型组大鼠子宫呈灰白色，充血水肿明显，柔韧度和弹性降低，与周围组织粘连严重，活动度变差，质地硬；与模型组比较，TGP低、中、高剂量组和妇科千金片组大鼠子宫充血水肿、柔韧度降低、与周围组织粘连等呈不同程度改善，其中TGP高剂量组和妇科千金片组子宫颜色接近正常，轻微充血水肿，少量膜性粘连，效果优于TGP低、中剂量组，见图1（插页）。与假手术组比较，模型组大鼠Verco评分升高（P＜0.01）；与模型组比较，TGP中、高剂量组和妇科千金片组Verco评分均降低（均P＜0.01）；TGP高剂量组与妇科千金片组Verco评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

表1 各组大鼠子宫子宫粘连评分比较（分）

图1 各组大鼠子宫大体状况观察[a：假手术组；b：模型组；c：妇科千金片组；d：白芍总苷（TGP）低剂量组；e：TGP中剂量组；f：TGP高剂量组]

2.2 各组大鼠子宫系数比较 与假手术组比较，模型组大鼠子宫系数升高（P＜0.01）；与模型组比较，TGP中、高剂量组和妇科千金片组大鼠子宫系数均降低（均P＜0.01）；与妇科千金片组比较，TGP高剂量组大鼠子宫系数降低（P＜0.01），见表 2。

表2 各组大鼠子宫系数比较

2.3 各组大鼠子宫组织病理学改变及病理评分比较 假手术组大鼠子宫组织结构清晰，肌纤维排列整齐，细胞形态正常，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠子宫呈现上皮细胞增生，肌纤维紊乱，大量炎性细胞浸润，腺体数量减少等病理性形态结构改变；与模型组比较，TGP低、中、高剂量组和妇科千金片组子宫病变呈不同程度改善，其中TGP高剂量组效果最为显著，见图2（插页）。与假手术组比较，模型组大鼠子宫宫腔扩张或粘连、上皮变性坏死、慢性炎症浸润、内膜充血水肿、上皮细胞增生5方面评分均升高（均P＜0.01）；与模型组比较，TGP中、高剂量组和妇科千金片组上述5方面评分均降低（均P＜0.01）；与妇科千金片组比较，TGP高剂量组上皮变性坏死、慢性炎症浸润评分均降低（均P＜0.01），但两组宫腔扩张或粘连、内膜充血水肿、上皮细胞增生评分比较差异均无统计学意义（均 P＞0.05），见表 3。

表3 各组大鼠子宫组织病理评分比较（分）

图2 各组大鼠子宫组织病理学检查所见[a：假手术组；b：模型组；c：妇科千金片组；d：白芍总苷（TGP）低剂量组；e：TGP中剂量组；f：TGP 高剂量组；HE 染色，×200]

2.4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均升高且IL-10水平降低（均P＜0.01）；与模型组比较，TGP中、高剂量组和妇科千金片组TNF-α、IL-1β水平均降低且IL-10水平均升高（均P＜0.05）；与妇科千金片组比较，TGP高剂量组TNF-α水平降低且IL-10水平升高（均P＜0.05），但TGP高剂量组与妇科千金片组IL-1β水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10水平比较

2.5 各组 大 鼠 子 宫 组 织 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠子宫组织 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表达水平均上调（均P＜0.01）；与模型组比较，TGP中、高剂量组 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 表达水平均下调（均P＜0.01）；与妇科千金片组比较，TGP高剂量组 NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3 表达水平均下调（均P＜0.01），见图 3和表 5。

表5 各组大鼠子宫组织NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达水平比较

图3 各组大鼠子宫组织NF-κB、转化生长因子-β1（TGF-β1）、Smad 同源物 2（Smad2）、Smad 同源物 3（Smad3）蛋白表达的电泳图[a：假手术组；b：模型组；c：妇科千金片组；d：白芍总苷（TGP）低剂量组；e：TGP 中剂量组；f：TGP 高剂量组]

3 讨论

慢性盆腔炎为女性上生殖道的常见病和多发病，患病率超过10%，与经期、性生活卫生、宫腔手术及流产等密切相关。临床上主要通过给予足疗程的广谱抗菌药物来治疗慢性盆腔炎，但长期应用抗菌药物可能导致人体菌群失调并产生耐药性，增加治疗难度[11]。近年来，随着对中医药认知的提升，中药多靶点、多方位的整体调节且毒副作用小的优点逐渐得到关注，其在慢性病治疗领域的应用日渐广泛。

白芍为我国传统中药品种，在《本经》《别录》等典籍中均有记载，其味苦、性微寒，具有养血调经、柔肝止痛之功效，用于血虚萎黄、胁痛，腹痛等症的调治。TGP为中药白芍的主要活性成分，包括芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等成分，具有良好的抗炎活性和免疫调节作用。妇科千金片由千斤拔、金樱根、穿心莲、功劳木、单面针、当归、鸡血藤、党参共八味中药配伍组成，具有抑菌、抗炎、提高免疫力等多种药理学作用，是临床治疗慢性盆腔炎的一线用药，总有效率达86%[12]。机械损伤联合混合细菌感染法制备的慢性盆腔炎动物模型与人类慢性盆腔炎的病理特征及发病机制十分相似，是目前最常用且公认的造模方法[13]。本实验采用机械损伤联合混合细菌感染的方法制备慢性盆腔炎大鼠模型后给予TGP进行治疗，以妇科千金片作为阳性对照药物，研究发现经TGP或妇科千金片治疗能够明显改善慢性盆腔炎大鼠子宫水肿、柔韧度和活动度，降低子宫粘连Verco评分和子宫系数，改善子宫上皮细胞增生、肌纤维紊乱、炎性细胞浸润等病变，降低宫腔扩张或粘连、上皮变性坏死、慢性炎症浸润、内膜充血水肿、上皮细胞增生病理评分，并且TGP高剂量组对子宫水肿及组织病理学改变的保护作用优于妇科千金片组，提示TGP对慢性盆腔炎大鼠子宫具有保护作用。

慢性盆腔炎病理机制非常复杂，其中炎症反应在其疾病进展过程中发挥着重要作用。病原菌激活机体免疫反应，诱导机体炎症细胞因子TNF-α、IL-1β大量释放，引发系列炎症反应进而导致子宫组织损伤；并且TNF-α、IL-1β作为炎性趋化因子能够刺激粒细胞进一步释放炎症因子，形成炎症级联反应，从而加重炎症损伤[14]。IL-10是机体关键的抗炎因子，对维持机体正常的免疫功能至关重要[15]。NF-κB是机体广泛存在的一种转录调节因子，具有促进炎症因子TNF-α、IL-1β合成与释放并抑制IL-10合成的作用，在机体炎症反应中具有关键调控作用[16]；TGF-β1是一种受NF-κB调控表达的多效性因子，参与调节细胞增殖、分化及凋亡过程，并且对慢性炎症、免疫应答具有重要调控作用；Smad蛋白是TGF-β1下游信号传导分子，其中Smad2、Smad3与受体结合被磷酸化活化后，能够将信号传递到细胞核而促转录活化[17]。杨静等[18]研究发现NF-κB/TGF-β1/Smad信号通路在慢性盆腔炎大鼠炎症反应及组织病理性损伤过程中发挥着重要调控作用。目前，TGP在临床上主要用于类风湿关节炎的治疗，近年来药理学研究发现TGP对肾脏、心肌等部位炎症也具有抑制作用[19-20]。本研究发现，TGP治疗能够明显降低慢性盆腔炎大鼠血清TNF-α、IL-1β水平并提高IL-10水平，下调子宫组织NF-κB、TGF-β1、Smad2、Smad3表达，并且 TGP 高剂量组上述作用优于妇科千金片组，提示抑制NF-κB/TGF-β1/Smad信号通路可能是TGP对慢性盆腔炎大鼠子宫起到保护作用的重要分子机制。本研究发现，经妇科千金片治疗能够明显降低血清TNF-α、IL-1β水平并提高IL-10水平，提示妇科千金片对慢性盆腔炎大鼠炎症反应具有抑制作用，与杨堃等[21]和李鑫等[22]研究报道一致；但妇科千金片对NF-κB/TGF-β1/Smad通路相关蛋白表达无显著影响，说明妇科千金片和TGP的作用机制可能不同。易丽贞等[23]研究发现妇科千金片对慢性盆腔炎大鼠炎症反应的抑制作用可能与调控Toll样受体4-磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路有关。

综上所述，TGP具有抑制慢性盆腔炎大鼠子宫粘连和组织病变的作用，其机制可能与抑制NF-κB/TGF-β1/Smad信号通路介导炎症反应有关。本研究结论为TGP作为慢性盆腔炎治疗备选药物提供了理论支持。纤维化是慢性盆腔炎所致子宫组织病变的另一重要机制[24-25]，TGP能否通过抑制纤维化对其起到保护作用还有待于进一步研究。