银杏叶黄酮对大肠杆菌生物膜的抑制作用

邵菊芳 龚春生 方婷婷 王翔宇 陈泽坤 朱红威

(中国矿业大学 化工学院，徐州 221116)

引 言

细菌生物膜是由细菌菌群分泌的黏液所形成的保护膜，可以避免或减少菌体受到外界环境的侵害。相对单个、分散、游离细菌的生存状态，生物膜是细菌适应外界环境的一种特殊生存形式。细菌生物膜是导致食源性疾病的主要诱因，可以造成食物变质，引发公共卫生问题[1-2]，因此在食品安全领域备受瞩目[3]。根据美国全国卫生研究所(NIH)预计，当食品污染事件发生时，问题的来源往往就是生物膜[4]。1996年因大肠杆菌(Escherichiacoli)O157污染导致的日本多所小学集体食物中毒事件，是人们熟知的重大公共卫生事件之一。因此，消除或抑制细菌生物膜对于保障人们的身体健康具有重要意义。

细菌生物膜可以使致病菌的耐药性提高，还能躲避宿主免疫系统的攻击[5-6]，具有顽固难清除的特点[7]。目前常用的消毒剂和抗菌剂对致病菌生物膜的清除效果并不明显，且这些消毒剂多为化学物质，对环境不友好。因此，寻找安全有效的消毒剂是食品安全领域亟待解决的问题之一。

近年来，天然植物成分对生物膜的抑制成为研究热点之一。天然植物中活性成分的种类繁多，且具有无毒、安全、环境友好等特点，成为筛选抑制细菌生物膜的优势资源库[8-13]。药用植物银杏(Ginkgobiloba)是我国传统且特有的树种，其中多种活性成分具有抑菌、抗感染的效果，作用靶点多，在治疗细菌感染方面独具优势。吴海霞[14]研究证明，银杏种仁酚酸对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均有较强的抑制作用，银杏种仁多糖对枯草芽孢杆菌有较强的抑制作用，银杏种仁蛋白对革兰氏阴性和阳性细菌均有抑制作用。黄小炯等[15]研究发现银杏果中的抗菌蛋白对大肠杆菌有较强的抑菌效果。赵琪珂[16]研究表明银杏叶多糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、八叠球菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制效果最好。邵菊芳[17]研究发现，当2.25 mg/mL银杏细胞黄酮与大肠杆菌作用10 h时，对大肠杆菌的抑制率高达81%。以上研究主要集中在银杏各成分对细菌菌体的抑制方面，而对细菌生物膜影响的研究甚少。因此，为了开发潜在的植物源杀菌消毒剂，本文以乙醇为提取溶剂从银杏叶中提取总黄酮，考察了银杏叶黄酮对大肠杆菌生物膜形成和黏附性的影响，以期为解决食品领域的细菌生物膜污染问题提供参考。

1 实验部分

1.1 实验材料和仪器

1.1.1实验材料

银杏叶采自中国矿业大学南湖校区校园内银杏树，品种为佛手；大肠杆菌BL21菌株、LB无菌液体培养基、U型96孔板，生工生物工程(上海)股份有限公司；芦丁标准品、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、琼脂、结晶紫、冰乙酸、甲醇、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂、酚酞、盐酸、氢氧化钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；DA201大孔树脂，天津波鸿树脂科技有限公司。

1.1.2实验仪器

DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；UV1780型紫外可见分光光度计，岛津企业管理(中国)有限公司；EL-204型分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SCIENTZ-Ⅱ型超声波粉碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；PYX-DHS-350型恒温培养箱、HYL-B型恒温摇床，太仓市璜泾镇强乐实验设备厂；SW-CJ-2D型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；2-16P型高速离心机，德国Sigma公司。

1.2 总黄酮标准曲线绘制[18]

配制质量浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准液100 mL，分别取芦丁标准液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL刻度试管中，用30%(体积分数)乙醇补至12.5 mL，加入0.7 mL NaNO2溶液(0.05 g/mL)，摇匀，放置5 min后加入0.7 mL Al(NO3)3溶液(0.1 g/mL)，放置5 min后加入5 mL 1 mol/L NaOH溶液，混匀，用30%乙醇稀释至刻度，混匀，静置10 min。使用紫外可见分光光度计于510 nm波长处测定吸光度，以芦丁的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3 总黄酮的提取纯化

采摘新鲜银杏叶500 g，于65 ℃烘干至恒重，研磨成粉末，过60目筛(筛孔尺寸为0.25 mm)备用[19]。称取银杏叶粉末10 g，以150 mL 75%(体积分数)乙醇为提取溶剂，超声波破碎处理，于30 ℃振荡2 s、间歇1 s，处理20 min。置于65 ℃的恒温水浴中1 h，过滤，将滤渣重新加入150 mL 75%乙醇中，加热3 h，过滤，弃滤渣，合并滤液[20]。利用1.2节绘制的标准曲线计算总黄酮的提取率，计算公式如下。

式中，E为总黄酮的提取率，%；m0为提取液中黄酮的质量，g；m为银杏叶粉末的质量，g。

使用DA201大孔树脂将黄酮初提液纯化[21]，使用旋转蒸发仪将纯化后的黄酮提取液减压浓缩，真空干燥，制得干粉保存备用。

1.4 生物膜的培养[22]

将活化的大肠杆菌BL21接种至100 mL LB液体培养基中，于37 ℃以200 r/min在恒温摇床中培养24 h，取对数生长期的细菌稀释100倍，以每孔0.1 mL加入到U型96孔板中。每孔菌液中加入0.1 mL LB培养基，混匀，以每孔0.2 mL的LB培养基为对照，在恒温培养箱中于37 ℃恒温培养。

1.5 生物膜生长曲线测定

吸去菌液，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)洗板3次，吸去洗液后晾干。加入甲醇固定20 min，吸去液体后晾干。将 0.05 mL结晶紫染色液(0.01 g/mL)加入孔板，轻摇使染色均匀。静置5 min，用去离子水冲洗孔板，晾干。吸取0.2 mL 33%(体积分数，下同)冰乙酸加入孔板，待生物膜完全溶解，加入到25 mL刻度试管中，用33%冰乙酸补至5 mL。使用紫外可见分光光度计在600 nm处测量不同培养时间的溶液的吸光度，以培养时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制生物膜生长曲线。

1.6 大肠杆菌抑菌率测定[23]

将黄酮干粉配制成质量浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL的7个梯度，以水为空白对照。取各浓度的黄酮溶液稀释1倍，以每孔0.1 mL加入到U型96孔板中，每个浓度做3个平行，共接种24孔。将活化培养24 h的大肠杆菌菌液稀释10万倍，各孔黄酮稀释液中接种0.1 mL菌液，于37 ℃在恒温培养箱中培养24 h。将培养液涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，每组涂布3个平板。于37 ℃恒温培养24 h，对菌落进行计数。没有大肠杆菌生长的平板上对应的银杏叶黄酮浓度为最小抑菌浓度(MIC)，按照下式计算对大肠杆菌的抑菌率。

式中，Ri为抑菌率，%；n0为空白对照的菌落数；n为实验组的菌落数。

1.7 银杏叶黄酮对生物膜的影响

1.7.1生物膜的分离

按照1.4节的方法接种大肠杆菌，将质量浓度为0(空白对照)、0.5、1、2倍MIC的黄酮溶液稀释1倍后取1 mL加入到菌液中，于37 ℃恒温培养48 h。称量各离心管的质量后，参照1.5节的方法溶解生物膜后，将各孔板中的菌液分别移入离心管，于7 800 r/min离心5 min，弃上清液，测定离心管加沉淀物的质量，按照下式计算生物膜质量。

Gf=G-Gt

式中，Gf为生物膜质量，mg；G为离心管加沉淀物的质量，mg；Gt为离心管的质量，mg。

1.7.2生物膜形成抑制率及黏附性抑制率测定

按1.4节的培养方法，经0(空白对照)、0.25、0.5、1倍MIC的银杏叶黄酮处理的大肠杆菌生物膜，于37 ℃培养24 h。按1.7.1节的方法分离生物膜，测定生物膜质量，按照下式计算生物膜形成抑制率。

式中，Rf为生物膜形成抑制率，%；G0为空白对照的生物膜质量，mg；G1为银杏叶黄酮抑制后的生物膜质量，mg。

按照1.5节的方法将生物膜进行染色洗板，用33%冰乙酸溶解生物膜，并补至3 mL。使用紫外可见分光光度计在600 nm处测量各样品染色液的吸光度，按照下式计算生物膜黏附性抑制率。

式中，Ra为黏附性抑制率，%；A0为空白对照的吸光度；A为实验组的吸光度。

1.7.3葡萄糖标准曲线绘制[24]

配制10 mg/mL葡萄糖标准液，分别取1.6、3.2、4.8、6.4、8、9.6 mL加入到25 mL刻度试管，加去离子水补至20 mL，加入1.5 mL DNS试剂后摇匀，沸水浴加热5 min。加去离子水补至25 mL，混匀。以未加入葡萄糖标准液的样液为空白，使用紫外可见分光光度计在540 nm处测定各管溶液的吸光度。以葡萄糖的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.7.4胞外多糖的水解、提取及生物膜多糖含量的测定[25]

于装有生物膜的离心管中加入0.1 mL 6 mol/L盐酸及0.15 mL去离子水，吸出样液加入到25 mL刻度试管中，在水浴锅中于100 ℃水解30 min。在此过程中防止蒸干，适当加入几滴蒸馏水，水解后测量其体积。待水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，加入6 mol/L NaOH溶液中和变色，得到待测液，测量其体积。取0.4 mL待测液，加入0.3 mL DNS试剂，在沸水浴中加热5 min，取出后加入去离子水补至5 mL，混匀，得到测定液。以不加生物膜的离心管为空白，使用紫外可见分光光度计在540 nm处测定吸光度，利用葡萄糖标准曲线，按照下式计算胞外多糖含量。

式中，C为胞外多糖含量，%；A0为空白对照的吸光度；V为待测液体积，mL；M为生物膜质量，mg。

2 结果与讨论

2.1 黄酮标准曲线及黄酮含量测定结果

图1为芦丁的标准曲线。芦丁的质量浓度ρ与吸光度A的关系式为：ρ=6.192A-0.000 8，决定系数R2=0.999，表明在0.008～0.048 mg/mL的范围内，芦丁的质量浓度与吸光度的线性关系良好。参照此标准曲线方程，可得乙醇提取后提取液中黄酮的质量浓度为0.15 mg/mL，计算得到提取率为1.71%。经DA201大孔树脂纯化后，纯化液中黄酮的质量浓度为1 mg/mL，减压浓缩后黄酮的质量浓度可达4.635 mg/mL，表明黄酮类化合物经纯化、浓缩，含量得到了显著的提高。

图1 芦丁的标准曲线

2.2 生物膜生长曲线

图2为大肠杆菌生物膜的生长曲线。生物膜的形成过程分为4个时期：黏附初期、黏附期、成熟期和脱落期[12]。由图2可知，大肠杆菌菌株在37 ℃培养2 h时完成初黏附，4 h形成成熟的生物膜，4～8 h生物膜脱落，8 h之后生物膜开始新的生长周期。在接下来的周期中，由于代谢产物的积累和营养物质的消耗，生物膜的生长变慢，周期变长。根据生长曲线，培养时间为12 h时生物膜最强壮，胞外基质最丰富，黏附性最强。

图2 大肠杆菌生物膜的生长曲线

2.3 银杏叶黄酮对大肠杆菌抑菌率的影响

图3为不同质量浓度的银杏叶黄酮对大肠杆菌抑制率的影响。由图3可知，4 mg/mL和8 mg/mL的银杏叶黄酮对大肠杆菌的生长有显著的抑制作用，抑菌率分别为99.59%和99.25%；0.25～2 mg/mL银杏叶黄酮的抑菌率为82.63%～89.42%；0.125 mg/mL银杏叶黄酮的抑菌率与空白对照组无明显差别，抑菌率约为16%。由此得出银杏叶黄酮对大肠杆菌的MIC为4 mg/mL。相对于肉桂(MIC为3.125 mg/mL)、丁香(MIC为6.25 mg/mL)等抑制作用广泛、用量低的植物杀菌剂[26]，银杏叶黄酮对大肠杆菌的抑菌活性为中等水平。

n=3，结果以“平均值±标准差”表示，下同。

2.4 银杏叶黄酮对生物膜形成量及黏附性的影响

图4为银杏叶黄酮对大肠杆菌生物膜形成量及黏附性的影响。由图4可知，当银杏叶黄酮的质量浓度为0.25倍和0.5倍MIC时，生物膜形成抑制率分别为22.72%和15.91%；质量浓度为1倍MIC时生物膜形成抑制率为59.09%，相比0.25倍和0.5倍MIC组分别提高了36.37%和43.18%。结果表明，银杏叶黄酮的质量浓度为1倍MIC时，对生物膜形成的抑制效果显著。

图4 银杏叶黄酮对大肠杆菌生物膜形成量及黏附性的影响

当银杏叶黄酮的质量浓度为0.25倍和0.5倍MIC时，黏附性抑制率分别为14.63%和10.02%；质量浓度为1倍MIC时黏附性抑制率为28.99%，相比0.25倍和0.5倍MIC组分别提高了14.36%和18.97%。结果表明，银杏叶黄酮的质量浓度为1倍MIC时，对生物膜黏附的抑制效果显著。

2.5 葡萄糖标准曲线及银杏叶黄酮对胞外多糖含量的影响

图5为葡萄糖的标准曲线。由图5可得葡萄糖的质量浓度ρ与吸光度A的关系式为：ρ=0.21A-0.025 2，R2=0.998 1，表明在0.8～4.8 mg/mL的范围内，葡萄糖的质量浓度与吸光度的线性关系良好。

图5 葡萄糖的标准曲线

图6为银杏叶黄酮对大肠杆菌生物膜胞外多糖含量的影响。由图6可知，银杏叶黄酮的质量浓度为1倍和2倍MIC时对生物膜多糖的抑制效果较为明显，在培养24 h时，胞外多糖含量相比对照组(0 MIC)分别减少了1.83%和2.12%。银杏叶黄酮的质量浓度为0.25倍和0.5倍MIC时，对生物膜多糖合成的抑制效果微弱，在培养48 h时胞外多糖含量分别比对照组减少0.18%和0.6%。结果表明，当银杏叶黄酮的质量浓度在1倍MIC以上时对大肠杆菌生物膜多糖的形成有明显的抑制作用。可以推测，银杏叶黄酮通过抑制胞外聚合物中多糖的分泌，抑制大肠杆菌生物膜的形成及黏附。

图6 不同质量浓度的银杏叶黄酮对大肠杆菌生物膜胞外多糖含量的影响

3 结论

银杏叶黄酮可抑制大肠杆菌菌体的生长，MIC为4 mg/mL；对大肠杆菌生物膜的形成和黏附有抑制作用，银杏叶黄酮的质量浓度为1倍MIC时，生物膜形成抑制率为59.09%，黏附性抑制率为28.99%；银杏叶黄酮的质量浓度在1倍MIC以上时，对大肠杆菌生物膜多糖的形成有明显的抑制作用。