刺五加提取物对酒精戒断大鼠海马去甲肾上腺素的影响

王加苇，吴宜艳，刘 欣

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

目前，中国大概有4.5亿饮酒消费者，其中约1.23亿人存在过度饮酒的行为[1]，而严重饮酒问题在医学上被归类为“酒精使用障碍”(alcohol use disorder,AUD)。这是一种慢性复发性脑疾病，其发作特征在于强迫性饮酒、无法控制饮酒量以及不饮酒时情绪低落。AUD的主要生理指征是精神焦虑、肾上腺素能亢进、中枢神经系统亢进和饮酒欲望的增强[2]。本研究以酒精戒断模型大鼠为研究对象，研究刺五加对酒精戒断焦虑样行为的作用，并且探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器刺五加浸膏(黑龙江珍宝岛药业股份有限公司，20190506)，95%乙醇，氯化钠注射液(0.9%)(哈尔滨市化工试剂厂分厂，批号：20200520分析纯)，磷酸二氢钾(恒兴试剂，批号：2020630色谱纯)，去甲肾上腺素标准品(上海源叶生物公司，批号：20210105色谱纯)，高效液相色谱仪LC2000(上海天美科学仪器有限公司)，离心机(eppendorf centrifuge 5424)，匀浆机(motor cordless749540-0000)，高架十字迷宫(上海欣软信息科技有限公司)。

1.2 分组与造模SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，体重220～250 g，由牡丹江医学院比较医学中心提供，许可证号：SCXK(黑)2019-00。动物房温度(22.0±2.0)℃，饲养期间自由饮食进水。将60只大鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白组、模型组、阳性药物组、高剂量刺五加组、中剂量刺五加组和低剂量刺五加组。空白组按体重进行腹腔注射生理盐水(15 mL/kg)作为对照，其他五组则按照体重腹腔注射20%(w/v)酒精(15 mL/kg)，1次/d，持续28 d，建立大鼠的酒精依赖。以大鼠进入开放臂的次数百分比和在开放臂停留的时间百分比的差别同时具有统计学意义时，评价为造模成功。3 d后，空白组和模型组用生理盐水灌胃作为对照(15 mL/kg)；刺五加浸膏用温水溶解成需要的浓度，高剂量刺五加组、中剂量刺五加组和低剂量刺五加组分别按照900 mg/kg、300 mg/kg、100 mg/kg的剂量灌胃，阳性药物组地西泮则按照5 mg/kg的剂量进行灌胃；所有组均1次/d，连续5 d。

1.3 行为学评价停止腹腔注射第3天和最后一次给大鼠灌胃给药1 h后，进行高架十字迷宫实验。高架十字迷宫装置由两条相对封闭臂(50 cm×10 cm)、两条相对开放臂(50 cm×10 cm×40 cm)以及中央区(10 cm×10 cm)组成。实验开始时，将大鼠从中央区域面向闭合臂放入迷宫，由软件自动记录5 min内的活动情况。

采集器记录的指标包括：开放臂的进入次数(open arm entry,OE)，在开放臂的停留时间(open arm time,OT)，闭合臂的进入次数(close arm entry,CE)，在闭合臂的停留时间(close arm time,CT)。根据记录的数据计算以下指标：进入开放臂和闭合臂的总次数(OE+CE)：用于表示大鼠的自主活动性；进入开放臂的次数百分比(OE%)=OE/(OE+CE)×100%和在开放臂停留的时间百分比(OT%)=OT/(OT+CT)×100%。OE%和OT%与大鼠的焦虑情绪成负相关，OE%和OT%越小，说明老鼠的焦虑情绪越严重。

1.4 HPLC测试大鼠海马组织去甲肾上腺素含量

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Kromasi 100-5 Cl8(4.6 mm×250 mm)，流动相：0.15 mol/L磷酸二氢钾(pH=5.5)-甲醇=9∶1，流速1 mL/min，等度洗脱，检测波长：280 nm，柱温30 ℃。

1.4.2 对照品溶液的制备 精密称定去甲肾上腺素标准品2 mg，并用0.1 mol/L的高氯酸溶解、定容至50 mL，得到40 ng/μL的标准品贮备液。取适量贮备液，分别稀释为20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、2.5 ng/μL、1.25 ng/μL的对照品溶液。

1.4.3 海马脑组织匀浆样品的制备 5%水合氯醛麻醉大鼠，断头处死，迅速取出海马，称重，将4 ℃保存的0.1 mol/L高氯酸按照1 mL/g加入至海马样品中，在冰盘中进行1 min的匀浆后，立即15000 r/min离心20 min后取出上清液，将上清液再次在15000 r/min的条件下离心20 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤，迅速进样。

1.5 统计学方法SPSS 22.0软件对实验结果进行分析，计量资料用“均数±标准差”表示，计数资料以n(%)表示。采用单因素方差分析(ANOVA)，运用Dunnett-t检验多重比较，P<0.05则具有统计学意义。

2 结果

2.1 刺五加提取物对大鼠OE%和OT%的影响给药前，相对于空白组，其余各组的OE%和OT%显著降低，说明大鼠酒精戒断模型造模成功；给药后，相对于模型组，高剂量刺五加明显提高了酒精戒断大鼠OE%(P=0.0108)和OT%(P=0.0267)；但是与模型组相比，中、低剂量的刺五加对酒精戒断的大鼠焦虑的影响不显著(P>0.05)；与阳性药物组相比，高剂量刺五加组的作用无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 六组大鼠OE%和OT%比较

2.2 HPLC测定结果

2.2.1 去甲肾上腺素的线性范围、标准曲线 取对照品溶液，在上述色谱条件下各进样20 μL，以峰面积Y为纵坐标，以进样浓度X(ng/μL)为横坐标作图，检测线性范围为1.25 ng/μL～40 ng/μL，峰面积与进样浓度成良好的线性关系；通过SPSS 22.0软件进行线性回归模拟，得到线性回归方程。如图1所示，经SPSS 22.0得到去甲肾上腺素的标准品线性回归曲线方程为：y=10.0188x-0.6970(R2=0.9998)。

图1 HPLC条件下绘制的去甲肾上腺素的标准曲线

2.2.2 仪器精密度及重复性试验 按照1.4.1色谱条件，取浓度为20 μg/mL的去甲肾上腺素对照品液连续测定5次，测得精密度RSD为2.6%，表明仪器精密度良好。取同一样品5份，进样，考察样品峰面积的日内精密度，结果表明，去甲肾上腺素的峰面积相对标准偏差(RSD)为3.2%，表明试验方法具有良好的重复性。

2.2.3 加样回收率试验 取浓度为20 μg/mL的去甲肾上腺素对照品溶液16 μL、20 μL、24 μL加入6 份海马匀浆液样品中，按“1.4.3”项下方法处理，测定含量，以计算方法回收率。结果见表2。

表2 回收率测定结果

2.2.4 大鼠海马中去甲肾上腺素的含量 结果显示(表3)，与空白组相比，模型组的去甲肾上腺素浓度明显升高(P=0.003)；与模型组相比，高剂量刺五加组的去甲肾上腺素含量降低(P=0.029)；中低剂量刺五加组的去甲肾上腺素的降低不显著(P>0.05)。

表3 HPLC检测六组大鼠海马中去甲肾上腺素的浓度

3 讨论

对去甲肾上腺素能神经在中枢神经的作用机制的研究显示，去甲肾上腺素能神经元支配边缘和前脑的关键区域，这些区域参与觉醒、强化和压力反应过程，参与AUD的发展和维持。去甲肾上腺素能神经元胞体聚集在脑干和脑桥的七个离散的核中，其轴突广泛投射到大脑和脊髓。这些核中最大、最具特征的是蓝斑(A6)。而海马接受了大量的来自蓝斑的肾上腺素能纤维投射，海马内分布着丰富的肾上腺素能受体。经过证明，它与应激、焦虑、酒类和阿片类药物反应有关[6]。过度的去甲肾上腺素能激活，伴随着酒精戒断和压力反应，产生焦虑。

本研究的高架十字迷宫测试的实验结果表明，酒精戒断后大鼠表现出了焦虑样症状，但在使用高剂量的刺五加浸膏灌胃治疗后，焦虑样症状得到了缓解。高效液相的结果则从神经递质的角度，揭示其起作用的机制，即降低酒精戒断大鼠的海马中去甲肾上腺素的浓度。而临床上针对性用药也印证了这一点[7]，针对肾上腺素能神经的受体药物可以用于治疗AUD，比如：阻断突触后α-1受体(哌唑嗪和多沙唑嗪)或突触后β受体(普萘洛尔)，或作用于突触前α-2受体(可乐定)的药物，经临床证明，都可减少患者临床前和临床中的酒精摄入，改善患者AUD症状。

综上所述，本研究证实刺五加提取物的应用，可使酒精戒断大鼠的焦虑行为得到缓解，并且改善了由于酒精戒断引起的海马中去甲肾上腺素水平升高，为进一步探讨刺五加提取物治疗酒精戒断后的焦虑提供了依据。