王波,杨讯,韩海心,辛叶,杨旭
(南阳市中心医院输血科,河南 南阳 473000)
药物诱导免疫性溶血性贫血(drug-induced immune hemolytic anemia,DIHA) 是一种免疫球蛋白G (immunoglobulin G,IgG) 或免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM) 介导细胞毒性抗体的II型变态反应,因在临床较为少见,故容易被忽视[1,2]。DIHA 发病机制是机体中产生某种药物的抗药物抗体,如药物再次使用将导致溶血,多见于患者使用抗菌药物后[3,4]。目前临床鲜有关于药物性抗体及其检测方式的相关报道,患者发生溶血后分析其发生原因面临着一定的困难。 微柱凝胶法是一种通过观察凝胶柱介质中红细胞抗原和相应抗体的凝集反应判断是否有抗体生成的新型免疫学检测技术,相较于以往的试管法抗人球蛋白实验、菠萝酶法具有操作简便、耗时短等优势,但关于其应用于抗菌素药物性抗体生成情况的检测中的研究尚少[5,6]。 头孢菌素类药物在临床有着广泛的应用范围,其中80%左右可诱发DIHA,同时相关报道也所有增加[7-10]。 头孢唑啉钠和头孢西丁钠分别属于第一代、第二代头孢菌素,抗菌谱广,杀菌力强,通常用于敏感性菌株感染性疾病的治疗。 本研究选取使用头孢唑啉钠和头孢西丁钠的168 例患者为研究对象,分析微柱凝胶法检测两种药物诱导形成药物性抗体的可行性。
1.1 一般资料 选取2018年10月-2020年2月本院采用头孢唑啉钠和头孢西丁钠治疗的患者168例,男91 例,女77 例;年龄19~78岁,平均(47.16±5.39)岁;头孢唑啉钠治疗98 例,头孢西丁钠治疗70 例。 纳入标准: 入院前7 d 未使用抗菌药物治疗; 入院后采用头孢唑啉钠和头孢西丁钠治疗>3 d; 采用药物治疗后血液标本中血红蛋白水平<用药之前。 本研究经院伦理委员会批准通过,所有受试者签署知情同意书。
1.2 药物、试剂与仪器 头孢唑啉钠(1.0 g;深圳立健药业有限公司;国药准字H20143067);头孢西丁钠(1.0 g; 扬子江药业集团有限公司; 国药准字H20057973);LISS/Coombs/IgG +C3d 微柱凝胶卡(管中为中性凝胶,并含抗人球蛋白血清、低离子介质,中山市生科试剂仪器有限公司);O 型血健康受试者新鲜血液(采集自健康献血者,EDTA 抗凝后冷藏);待检血液(采集自头孢唑啉钠和头孢西丁钠治疗的患者,EDTA 抗凝后冷藏)。
医学检验多功能离心机TD2Y(中山市生科试剂仪器有限公司);F37-12X2 37℃恒温孵育器(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 间接抗人球蛋白试验(Indirect Antiglobulin Test,IAT) 筛查不规则抗体 清晨采集患者空腹状态下5ml 左右静脉血,加入EDTA 抗凝。 血浆标本与不规则抗体筛查细胞各50μl,加入微柱凝胶试验卡(含抗球蛋白试剂),37℃下孵育20min,1000 r/min 离心半径12cm 离心3min,2000r/min 离心半径10cm 离心2min,判定结果。
1.3.2 直接抗人球蛋白试验 (direct antiglobulin test,DAT) 用0.9%的氯化钠溶液经浓缩红细胞稀释为0.8%红细胞悬液,取50μl 加入微柱凝胶试验卡(含抗球蛋白试剂),1000r/min 离心半径12cm离心3min,2000r/min 离心半径10cm 离心2min,判定结果。如标本DAT 结果为阳性,继续检测其血浆及放散液中药物性抗体; 如标本DAT 结果为阴性,继续检测其血浆中药物性抗体。
1.3.3 放散实验 从DAT 结果阳性标本中采集浓缩红细胞1ml,经生理盐水洗涤3 次,严格按照《输血技术操作规程》进行酸放散试验,并快速离心、分离放散液。
1.3.4 制备空白O 型人红细胞 采集20 例O 型血健康受试者新鲜血液,混合均匀后取压积红细胞10ml 于试管中,再混合生理盐水90ml,2500r/min离心半径10cm 离心3min,弃上清,采用生理盐水将红细胞洗涤3 次,制备为不含有药物的空白红细胞待用。
1.3.5 制备头孢唑啉钠、 头孢西丁钠包被红细胞药物0.1 g 溶于巴比妥缓冲液(pH 为9.6~9.8)0.25 ml 中,并与洗涤后O 型红细胞170μl 混合均匀;另取一试管,加入等量巴比妥缓冲液与O 型红细胞。两试管均于室温下孵育2h,每10min 轻摇匀1 次,之后生理盐水洗涤3 次红细胞,前者即为头孢唑啉钠、头孢西丁钠包被红细胞,后者即为无药物包被红细胞。 使用前采用生理盐水配置为2%红细胞悬液。
1.3.6 鉴定药物包被红细胞 抗体检测试剂盒阳性与阴性对照试剂(50μl)和2%红细胞(药物包被、无药物包被各25μl)混合,加入微柱凝胶卡,37℃孵育1h,1000r/min 离心半径12cm 离心3min,2000r/min 离心半径10cm 离心2min。 采用两种头孢抗菌素抗体阴性与阳性对照检测试剂检测药物包被红细胞,判定是否包被成功。
1.3.7 微柱凝胶柱凝集试验检测药物性抗体 取20μl 2%头孢唑啉钠和头孢西丁钠红细胞悬液,置于微柱凝胶柱上,同时再加100μl 待测血清,放置于恒温孵育器中孵育20min,然后经卡式定速离心机离心(1030r/min 离心15min)。 微柱凝胶抗人球蛋白卡自左向右标记4 个孔,第1 个孔加入患者血浆/放散液50μl,药物包被O 型红细胞25μl;第2 个孔加入患者血浆/放散液50μl,无药物包被O型红细胞25μl; 第3 个孔加入混合的0 型红细胞对应血浆50μl,药物包被O 型红细胞25μl; 第4个孔加入混合的0 型红细胞对应血浆50μl,无药物包被O 型红细胞25μl。观察微柱凝胶离心结果,阴性:红细胞悬液沉积至微柱凝胶底部;阳性:红细胞悬液滞留于微柱凝胶上;弱阳性:红细胞群滞留于凝胶柱中间。 记录凝集结果,如仅有第1 个孔中发生凝集,则为药物性抗体阳性。
1.4 统计学方式 采用SPSS 19.0 对数据进行处理与分析,以[n(%)]表示计数资料,理论频数为1~5时行校正χ2检验,>5 时行χ2检验。 P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 IAT 检测结果 168 例血浆标本中不规则抗体筛查结果均未出现阳性。
2.2 DAT 检测结果 168 例血浆标本中DAT 结果阳性32 例(19.05%),其中采用头孢唑啉钠治疗的患者阳性20 例,采用头孢西丁钠治疗的患者阳性12 例。
2.3 药物包被红细胞鉴定结果 微柱凝胶抗人球蛋白卡第1 孔(加入阴性对照试剂与药物包被红细胞)无凝集,第2 孔(加入阴性对照试剂与无药物包被红细胞)无凝集,第3 孔(加入阳性对照试剂与药物包被红细胞)凝集,第4 孔(加入阳性对照试剂与无药物包被红细胞)无凝集。 由此可见,仅有第3 孔发生凝集,提示药物包被红细胞成功。
2.4 头孢唑啉钠、 头孢西丁钠药物性抗体阳性率头孢唑啉钠药物性抗体阳性率高于头孢西丁钠(P<0.05); 头孢唑啉钠DAT 结果阳性标本与头孢西丁钠DAT 结果阳性标本中药物性抗体阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05);头孢唑啉钠DAT结果阴性标本中药物性抗体阳性率高于头孢西丁钠DAT 结果阴性标本(P<0.05)。 见表1。
表1 头孢唑啉钠、头孢西丁钠药物性抗体阳性率比较[n(%)]
2.5 DAT 阳性标本放散液检测结果 头孢唑啉钠、头孢西丁钠DAT 结果阳性标本中不规则抗体检测结果均为阴性,药物性抗体均为阳性。 见表2。
表2 DAT 阳性标本放散液检测结果
机体中生成药物依赖性抗体是导致DIHA 的常见机制,通常为头孢类药物、哌拉西林等所致,DAT 试验结果为阳性时患者常表现为贫血、乏力、黄疸等溶血征象,苍白、黄疸、脾肿大、淋巴结肿大等,甚至危及生命[11]。 因此,用药前采取准确、有效的药物性抗体监测预警技术,减少DIHA 发生,保障临床用药安全,避免药物诱导性抗体导致的输血性溶血。
微柱凝胶法通过离心技术、凝胶过滤技术、抗原抗体发生反应的原理,凝集的红细胞不能穿过凝胶间隙,留置于凝胶上层,从而呈现阳性结果,而未发生凝集的红细胞在离心力作用下可穿过凝胶间隙沉积于凝胶柱底部,从而呈现阴性结果[12,13]。DAT 是检测机体中已被补体或不完全抗体致敏的红细胞,通常用于新生儿溶血病、 溶血性输血反应、药物性溶血性贫血等的检测。 既往研究显示[14],DAT 结果阳性的标本与药物性抗体关系密切。 本研究结果显示,168 例患者血浆标本与DTA 结果为阳性的标本放散液中不规则抗体均显示阴性,可排除实验过程中血型相关意外抗体阳性导致假阳性的可能性。此外,本研究的DAT 结果阳性标本中,血浆与放散液中均存在有两种头孢抗菌素的药物性抗体;且DAT 结果阴性标本中,同样存在两种头孢抗菌素药物性抗体。 分析原因可能为:DAT阳性结果可能并非药物性抗体所致; 部分患者在发生DIHA 部分症状时,已经接受了抗菌药物治疗,诱使红细胞表面吸附大量药物性抗体,导致DAT 阳性。 通常情况下,采用抗人球蛋白介质试管法时需要洗涤红细胞3 至4 次后才可用于检测,但即使洗涤后血清蛋白极微量的残留也可能与抗人球蛋白试剂中和。 洗涤不标准、不完全均可能导致结果可靠性降低,还可能由于抗体分子太少与红细胞结合后无法被检测出来。 根据红细胞与IgG结合的检测方式因采用的检测方式不同而结果存在差异,相较于试管法,微柱凝胶法敏感性更强,该检测方式不需要洗涤红细胞,标准加样与结果判断标准可控也是其优势之一[15,16]。然而,在某些特殊情况下,例如变形性较差的镰状细胞难以正常通过凝胶柱,影响结果判断的准确性,需临床检测人员细心观察并分析患者临床诊断结果,需要时使用试管法DAT 鉴定、分析。
此外,本研究结果中,头孢唑啉钠及其DAT 阴性标本中药物性抗体阳性率均高于头孢西丁钠,提示头孢唑啉钠面临着更高的药物性抗体形成风险; 两种头孢抗菌素的DAT 阳性标本中药物性抗体阳性率比较,差异无统计学意义,分析原因可能是当DAT 表现为阳性时,患者已出现DIHA 相关症状,该种情况下产生的药物性抗体可能与药物的使用无关。
综上所述,微柱凝胶法检测头孢唑啉钠和头孢西丁钠诱导形成药物性抗体时操作简便,结果稳定,可行性强,可用于临床检验工作。 采用头孢唑啉钠和头孢西丁钠诱发DIHA 大多为外科手术围术期预防性使用抗生素患者,如输血患者发生溶血,特别是血管内溶血时需要和输血反应进行鉴别,以防误诊。 即便患者仅对一种头孢菌素发生DIHA,同样需建议其今后注意使用其他头孢类药物。