胆石症胆汁成份及OPN 活性变化、血清瘦素变化与结石形成的关系研究

马兴乐，刘海潮，李会转

（郑州大学附属洛阳中心医院肝胆胰脾疝外科，河南 洛阳 471009）

胆石症属于消化系统常见病，其中胆固醇结石属于最常见的类型，随着人们饮食结构及生活方式的变化，胆石症的发病率呈显著升高趋势[1]。胆固醇从胆汁析出并结晶是胆固醇结石的首要形成条件，其中抑制或促进胆固醇成核过程的多种因子均具有重要的调节作用。 骨桥蛋白（osteopontin,OPN）广泛存在于多种细胞和组织中，属于磷酸化的糖蛋白，研究[2]提示胆汁OPN 作为重要的抑核因子，具有延长胆固醇成核、结晶的作用。 瘦素是机体脂肪代谢的重要因子，胆固醇由肝细胞代谢并由胆道排出，胆汁浓缩于胆囊内，促进胆固醇析出、结晶和沉淀，因而80%胆固醇结石存于胆囊[3]。 但现阶段关于胆囊结石与OPN、瘦素等因子的研究资料较少，OPN、 瘦素在胆固醇结石的形成过程中如何发挥作用尚存在争议。 故而，本研究探讨了胆固醇结石患者胆汁成份、 胆汁中OPN 活性及血清瘦素的变化及在胆结石形成中的作用，报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月-2018年8月本院经手术治疗的胆固醇结石患者60 例（胆石症组，n=60）、60 例因胆囊息肉实施手术治疗的患者（息肉组，n=60）。 胆石症组，年龄37～69岁，平均52.2±6.8岁；性别构成：男21 例、女39 例；结石最大径6.2±1.9mm；其中胆囊结石单发13 例、多发47例。 息肉组，年龄39～69岁，平均54.0±6.1岁；性别构成：男25 例、女35 例。 两组患者的年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），研究经本院医学伦理委员会批准，符合医学伦理学要求。

1.2 相关标准 诊断标准[4]：胆固醇结石患者的诊断标准参考《外科学》人民卫生出版社第八版中的标准。 纳入标准：⑴患者年龄39～69岁；⑵胆囊结石和胆囊息肉患者均在我院接受腹腔镜下胆囊切除手术；⑶手术前未使用降胆固醇相关药物、非甾体类抗炎药、生长抑素等药物；⑷本研究符合《赫尔辛基宣言-人体医学研究的伦理准则》。 排除标准：⑴胆囊及胆管、肝脏部位的恶性肿瘤；⑵胆道寄生虫病；⑶严重的肝肾功能疾病；⑷近3 个月内具有肝胆系统的炎症病史； ⑸伴有其他系统的重大疾病。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 患者全麻建立气腹, 进入光纤镜头,在镜头引导下置入剑突下及肋缘下戳卡，无损伤钳提起胆囊，适度降低气腹压力，使胆囊底贴近腹壁，镜头引导下胸穿针自腹壁刺入胆囊底，抽取胆汁5ml，荷包缝合胆囊穿刺点后胆囊及腹壁穿刺点消毒。 分装与无菌管中，低温离心15min，1500G/min，去除杂质及沉淀，加入胆汁保存液（0.05%氯霉素，3mM 叠氮钠，1mM 亮抑酶肽和5mM 依地酸钠），深低温保存，分批检测。

1.3.2 检测方法 胆汁组分浓度检测 胆汁标本室温解融后，全自动生化分析仪（美国GE 公司生产）检测两组胆汁中总胆固醇（TC）、总胆汁酸（TBA）水平；酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清瘦素水平，OPN 浓度检测采用ELISA 法，相关试剂盒均购于南京建成生物研究所，检测过程严格按照试剂及仪器说明书进行。

胆汁成核时间检测 成核时间检测参照HOLAN 等人的方法，胆汁标本室温解融后，超速离心，滤过膜过滤(0.22μm)，吸取胆汁460μl 加入检测管，然后依次加入OPN （2.5mg/ml）、 白蛋白（5mg/ml）、 氯化钙(250μmol/L 各20μl，37℃平衡30min 后每12h 在偏光显微镜下观察析出情况及时间为成核时间。

1.4 统计分析 本研究中所有数据的分析均采用SPSS21.0 版本，年龄、胆汁酸中TC、TBA 水平等指标采用±s 表示，组间比较采用t 检验；性别比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson 线性相关分析法；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胆石症组患者和息肉组患者的胆汁酸中TC、TBA 水平比较 经两组独立样本t 检验，胆石症组患者的胆汁酸中TC、TC/TBA 水平显著高于息肉组（P＜0.05），胆石症组和息肉组患者的胆汁酸中TBA水平差异无统计学意义（P＞0.05）；见表1。

表1 胆石症组患者和息肉组患者的胆汁酸中TC、TBA 水平比较（±s）

表1 胆石症组患者和息肉组患者的胆汁酸中TC、TBA 水平比较（±s）

组别 n胆石症组息肉组t 值P 值60 60 TC（mmol/L） TBA（mmol/L）13.28±1.66 11.43±1.20 6.996 0.000 122.8±31.9 135.2±38.0-1.936 0.055 TC/TBA 0.108±0.022 0.085±0.028 5.112 0.000

2.2 胆石症组患者和息肉组患者的胆汁酸中OPN蛋白浓度、成核时间及血清瘦素水平比较 经两组独立样本t 检验，胆石症组患者的血清瘦素水平显著高于息肉组（P＜0.05）； 胆石症组患者胆汁酸中OPN 蛋白浓度、成核时间均低于息肉组患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）；见表2。

表2 胆石症组患者和息肉组患者的胆汁酸中OPN蛋白浓度、成核时间及血清瘦素水平比较（±s）

表2 胆石症组患者和息肉组患者的胆汁酸中OPN蛋白浓度、成核时间及血清瘦素水平比较（±s）

组别 n OPN 浓度（ng/ml）OPN 蛋白成核时间（d）胆石症组息肉组t 值P 值60 60 69.41±6.52 82.50±7.78-9.989 0.000 17.51±2.04 20.83±1.20-10.866 0.000血清瘦素（ng/ml）8.40±2.73 5.28±1.50 7.759 0.000

2.3 胆石症组患者胆汁酸中OPN 蛋白浓度 血清瘦素水平与胆汁酸中TC、TC/TBA 的相关性 经Pearson 线性相关分析法分析，胆石症组患者的血清瘦素水平与胆汁酸中TC、TC/TBA 呈显著正相关关系（P＜0.05）；胆石症组患者胆汁酸中OPN 蛋白浓度与胆汁酸中TC、TC/TBA 呈负相关关系（P＜0.05）；见表3。

表3 相关性分析结果

3 讨论

胆囊动力学异常、胆固醇结晶水合物沉着、胆囊胆汁成核、 过饱和均是形成胆固醇结石的主要生理病理机制，其中胆固醇结晶沉淀是结石形成的最关键环节[5,7]。 正常条件下，胆囊胆汁中的胆固醇主要以胆固醇磷脂泡及微胶粒的形式保持溶解状态，但是胆汁中的胆固醇超过大泡的最大承载力，胆固醇将析出、结晶和沉淀，而胆汁酸与胆固醇、磷脂的相对浓度比决定了胆固醇的溶解度。

本研究结果显示胆石症组患者的胆汁酸中TC、TC/TBA 水平显著高于息肉组，胆石症组和息肉组患者的胆汁酸中TBA 水平差异无统计学意义。,提示在胆囊结石的形成过程中，胆汁中胆固醇的浓度具有决定性的作用，其主要原因是胆固醇的浓度过高或过饱和，而非胆汁酸的浓度下降，提示在胆固醇结晶析出的过程中，胆汁中胆固醇浓度过高是主要的因素。

OPN 属于分泌型磷酸化糖蛋白，能够调节机体的病理生理过程，其在胆囊、肝脏及胆汁中均存在高表达，近年来才有学者[8-10]提出OPN 可能参与了胆石症的发生、发展过程。 本研究结果显示胆石症组患者的血清瘦素水平显著高于息肉组； 胆石症组患者胆汁酸中OPN 蛋白浓度、 成核时间均低于息肉组患者，差异具有统计学意义。 该结果说明胆石症患者瘦素水平较高、OPN 水平较低且OPN结构上也可能存在差异，导致成核时间缩短及抑制胆固醇结石形成的能力下降。 肝内胆管结石患者的腺体及结石均发现OPN 表达，OPN 能够抑制胆汁胆固醇的结晶生长，稳定磷脂泡和胆固醇，进而抑制胆固醇的析出。 瘦素是脂肪细胞分泌的激素，最初发现预脂肪细胞，瘦素受体可广泛表达于全身各组织，因此瘦素在全身的各个脏器组织均可发挥作用。 动物实验[11-13]发现狗胆囊结石的形成及胆囊囊肿均与瘦素及其受体关系密切，既往的研究认为[14]，瘦素能够清除脂肪中的胆固醇，加速体内的胆固醇的排泄，因此能够引起胆汁中的胆固醇过饱和，从而更利于胆固醇结晶的形成，但在胆汁中瘦素的表达情况尚少有研究，在本组资料中胆囊结石组胆汁中瘦素的水平增高，考虑其可能通过对胆汁中胆固醇代谢的干扰促进胆固醇结晶的析出，而且其尚可能通过调节胆囊收缩素的作用影响胆囊的排空功能[15]，进而存进胆囊结石的形成。

进一步对胆石症组患者胆汁酸中OPN 蛋白浓度 血清瘦素水平与胆汁酸中TC、TC/TBA 的相关性研究发现胆石症组患者的血清瘦素水平与胆汁酸中TC、TC/TBA 呈显著正相关关系； 胆石症组患者胆汁酸中OPN 蛋白浓度与胆汁酸中TC、TC/TBA 呈负相关关系。 该结果提示胆固醇结石患者胆汁中OPN 蛋白的浓度及活性减低、 血清瘦素水平升高, 可能与胆汁成份失调、 胆结石形成有关[16.17]。

综上所述，胆固醇结石患者胆汁中OPN 蛋白的浓度及活性减低、血清瘦素水平升高，并且与胆汁中TC 及TC/TBA 的比值具有相关性，而在两组患者的胆汁中TBA 的水平并未表现出明显的差异。 研究结果提示在胆囊结石形成的过程中，胆汁中的胆固醇浓度过高引起的过饱和现象是主要的因素之一，而OPN 的浓度过低，能够影响胆汁泡的稳定性，导致晶体的析出，此外瘦素能够通过对胆固醇代谢的调节以及对胆囊收素的调节等途径参与胆囊结石的形成过程。 提示在胆囊结石手术过程中，通过对胆汁中上述成分的检测，能够为胆囊结石形形成提供进一步的基础理论，也能够为术后的药物干预提供参考依据。