香辛料提取物对低盐酱卤鸡肉保鲜效果研究

刘晓柳 ，赵士豪 , ，李树立，高志鑫，魏青柳

（1.河北经贸大学生物科学与工程学院，石家庄 050061；2.河北省禽肉深加工技术创新中心，石家庄 050061；3.河北经贸大学研究生学院，石家庄 050061）

鸡肉是我国第二大消费肉类，酱卤制品是其主要加工产品之一。据调查，现有酱卤鸡肉产品食盐含量约600～1 800 mg·100 g-1，食盐含量过高，钠摄入量超过营养学建议标准，增加罹患高血压、中风和心血管疾病风险[1-2]，因此低盐肉类产品需求逐年增加，而减盐则可能引发化学防腐剂滥用等食品安全问题。因此，在保证原有风味、质构、货架期等品质基础上，研究低盐食品加工过程保鲜技术，实现化学防腐剂零添加成为关注焦点。延长肉制品货架期方式包括添加食品添加剂[3]、辐照处理[4]、微波处理[5]和气调包装[6]等。香辛料是天然保鲜剂重要成分，可发挥调味和保鲜双重作用[7]，成为肉制品保鲜剂研究热点。

探讨食品贮藏期菌群结构对于研究微生物与食品关系、测定食品货架期具有重要理论和现实意义。近年来，高通量测序技术以其数据完整、分析内容丰富，在食品微生物菌群研究中应用日益普遍。刘均等将高通量测序技术应用于冷鲜鸡肉保质期测定和菌群测定[8]，薛静应用高通量测序技术验证即食生制章鱼制品菌群[9]。

本研究测定白芷、丁香、迷迭香、百里香、青花椒、红花椒等香辛料水提液和醇提液对低盐酱卤鸡胸肉中混合腐败菌抑制效果，筛选具有抑菌作用的提取物并通过响应面优化试验获得最优复配组合。分析最优配方处理下低盐酱卤鸡胸肉贮藏期内挥发性盐基氮、菌落总数变化趋势，判别最优配方实用价值。利用高通量测序技术探究贮藏期内细菌群落多样性变化规律，明确导致低盐酱卤鸡胸肉腐败的优势菌群，解析复配香辛料提取物保鲜机制，为后续低盐肉制品保鲜技术持续改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冰鲜白羽鸡大胸购自河北省石家庄市北国超市，采用KCl和MgCl2部分替代加工过程中NaCl制备低盐酱卤鸡胸肉[10]，白芷、丁香、迷迭香、百里香、青花椒、红花椒购自瑞琪中药材有限公司；牛肉膏、蛋白胨、NaCl 购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

磨粉机，九阳股份有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂，RE-52CS；电热恒温培养箱，上海沪析实业有限公司，DPX-9052B-1；标准型均质机，上海沪析实业有限公司，HX-4；垂直流超净工作台，常州市固德仪器有限公司，BBS-CDS；手提高压蒸汽灭菌器，上海申安，DSX-18L；高速台式冷冻离心机，Eppendorf，5424R。

1.3 方法

1.3.1 天然保鲜剂制备

称取50 g 香辛料，经粉碎、浸泡、超声提取、浓缩、离心等工艺制备香辛料提取液，终浓度为10.0 g·mL-1。取上清液过滤除菌，放入4 ℃冰箱冷藏保存备用。

1.3.2 抑菌活性测定

采用牛津杯法测定香辛料提取液抑菌活性[11]，并分别以无菌水和乙醇为对照。

1.3.3 最小抑菌浓度（MIC）测定

取若干试管编号，并向各试管中加入培养基、香辛料提取液和稀释菌液（见表1），分别以0.25 mL 无菌水替代腐败菌液和0.3 mL 无菌水替代香辛料提取液作为阴性和阳性对照组。30 ℃振荡培养24 h 后，观察各试管混浊度，若试管出现混浊，则表示有细菌生长。若某标号试管以下不再发生明显混浊现象，则该试管提取液浓度为抑制腐败菌生长最低浓度，即MIC值。

表1 香辛料提取液最小抑菌浓度测定Table 1 Determination of the MIC of spices extracts

1.3.4 复合天然保鲜剂响应面设计

将上述试验所筛选得到3种香辛料提取液复配使用，以第6 天菌落总数为响应值，利用响应面优化试验比较替代前后产品在贮藏期内TVB-N和菌落总数，得到最优替复配保鲜配方并验证（见表2）。

表2 复合天然保鲜剂响应面设计Table 2 Response surface design on compound natural preservatives

1.3.5 复合天然保鲜剂对低盐酱卤鸡肉贮藏特性的影响

样品TVB-N 采用速测盒测定，在一定范围内，颜色深浅与TVB-N 浓度呈正比，颜色越深，含量越高。菌落总数根据GB4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》计数[12]，均表示为1 CFU·g-1。

1.3.6 复配香辛料提取物对低盐酱卤鸡肉制品贮藏期细菌群落多样性的影响

分别于0、2、4、6、8 d 在无菌室内将香辛料提取液处理样品和空白对照组切取10 g，于-80 ℃冰箱冻存。提取样品细菌总DNA，采用341F-806R为引物扩增细菌16S V3～V4区。

1.4 数据处理与分析

每组试验3 个平行，采用OriginLab（2021）和SPSS（20.0）处理试验数据，结果采用“平均值±标注差”表示。响应面采用Design-Expert 8.0.6 统计分析软件。测序样品细菌基因组16S V3～V4 区扩增后，采用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 建库，并利用Illumina公司Miseq PE300/NovaSeq PE250平台测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。采用fastp 软件对原始测序序列质控，使用FLASH 软件拼接，利用RDPclassifier对每条序列作物种分类注释，比对Silva 16S rRNA 数据库（v138），设置比对阈值为70%。

2 结果与分析

2.1 不同香辛料提取物抑菌性能测定

所选6种香辛料中，仅白芷、迷迭香和丁香提取物产生抑菌圈，其抑菌圈直径和MIC值如表3所示。抑菌圈直径排序，丁香提取液＞迷迭香提取液＞白芷提取液，且3 种香辛料醇提液产生的抑菌圈直径均大于水提液抑菌圈直径。浑浊度结果表明，香辛料提取液浓度越大，浑浊度越低，即抑菌效果越强，且MIC 结果与抑菌圈结果一致，显示出抑菌效果丁香提取液＞迷迭香提取液＞白芷提取液，醇提液＞水提液的特点。

表3 3种香辛料提取液抑菌性能比较Table 3 Comparation of the antibacterial activity of the three spices extracts

2.2 响应面法优化香辛料提取液复配配方

以丁香（A）、白芷（B）和迷迭香（C）浓度为自变量，以第6天样品菌落总数为响应值，建立三因素三水平中心组合，共17组试验方案。利用Design-Expert 8.0.6 软件，对上述试验结果作回归分析，响应值Y表达式为：

Y=+5.85950-13.68000A-3.75250B-10.15500C+20.50000AB+9.00000AC+4.00000BC+75.80000A2+10.20000B2+86.80000C2

该模型F=2.93，P＜0.01，表明模型与实际拟合良好，试验方法可靠，且失拟项P=0.1632，差异不显著，说明模型误差小，可用于丁香、白芷和迷迭香复配溶液对低盐酱卤鸡胸肉贮藏期菌落总数分析及预测。丁香提取物（A）P＜0.01，差异极显著；而白芷（B）和迷迭香提取物（C）P＞0.05，差异不显著，则3个因素对总菌落数影响顺序为：丁香＞白芷＞迷迭香。二次项A2、C2对总菌落数影响极显著，AB、AC、BC和B2影响不显著，表明各因素对总菌落数变化并非简单线性关系（见表4）。

表4 回归方程拟合及方差分析Table 4 Regression equation fitting and variance analysis

就响应面交互作用看，图1a 曲面平缓，等高线图为椭圆形，说明丁香和白芷交互作用不显著，这与方差分析结果一致。此外，在白芷含量一定情况下，菌落总数随丁香浓度变化较明显，即丁香对菌落总数的影响高于白芷。同理，由图1b和c可知，丁香对菌落总数影响高于迷迭香，白芷对菌落总数影响高于迷迭香。

图1 响应面交互作用Fig.1 Response surface interaction

2.3 复配香辛料提取物对低盐酱卤鸡肉制品贮藏特性的影响

以菌落总数最小值为目标，筛选出一组最佳配方：丁香0.02 g·mL-1、白芷0.05 g·mL-1和迷迭香0.15 g·mL-1，将其与空白组作对比分析，分别测定两组样品贮藏期内TVB-N 和菌落总数，验证响应面结果合理性。

如图2a 所示，在第0 天处理组和对照组TVBN 值分别为12.03 和12.07 mg·100g-1，差异不显著，说明复合提取液保鲜剂添加对低盐酱卤鸡肉制品初始TVB-N 值无影响。但处理组和对照组在第2、4、6、8、10天时测得TVB-N 值差距越来越大，在第8 天时对照组TVB-N 值陡峭上升，而处理组TVB-N 值仍呈缓慢上升趋势，说明在贮存过程中，处理组样品中所添加复合天然保鲜剂可减缓TVB-N值升高。

贮藏期内样品菌落总数变化情况如图2b 所示，可知，处理组和对照组菌落总数均随贮存时间增加而增加。第0天，处理组和对照组菌落总数值分别为4.75 lg（CFU·g-1）和4.78 lg（CFU·g-1），差异不显著，说明复合天然保鲜剂并未引入新的腐败菌，处理组和对照组在第2 天时测得菌落总数差异不显著，在第4 天后菌落总数值差异显著（P＜0.05）。在贮藏第10 天，样品组和对照组菌落总数分别达到5.51 lg（CFU·g-1）和5.92 lg（CFU·g-1），说明复配天然保鲜剂的使用，导致低盐酱卤鸡胸肉中总菌落数降低0.41 lg（CFU·g-1）。

图2 复配香辛料提取物对低盐酱卤鸡肉制品贮藏特性的影响Fig.2 Effects of compound spices extract on storage characteristics of salt-reduced sauced chicken

2.4 复配香辛料提取物对低盐酱卤鸡肉制品贮藏期细菌群落多样性的影响

2.4.1 贮藏期细菌群落多样性分析

细菌群落多样性检测结果显示（见表5），处理组和对照组检测覆盖率均达到0.99 以上，即存在未被检出序列可能性较小，所建文库较准确反映待测低盐酱卤鸡肉制品中细菌群落多样性。维恩图显示（见图3），处理组分类操作单元（OUT）数目为4 058 个，对照组OUT 数目为2 626 个，两组共有OUT数目为1 756个，表明处理组和对照组菌群结构差异性较大，即复配香辛料提取物添加对低盐酱卤鸡肉制品贮藏期细菌群落多样性产生明显影响。两组样品Chao、Ace指数在贮藏过程中呈逐渐减小趋势，表明样品中菌群丰富度逐渐减少，即在贮藏后期腐败菌群成为优势菌群。此外，就两组样品微生物物种丰富度和多样性看，处理组Shannon 指数高于对照组，而Simpson 指数低于对照组，表明经复配香辛料提取物处理后细菌群落多样性高于对照组，可能是由于高通量测序分析中死亡微生物基因片段仍被检测到，导致结果数值偏高。但与对照组相比，处理组Shannon 和Simpson 指数随时间变化不显著，说明取样期限内，处理组细菌群落多样性变化较对照组小，即复配香辛料提取物处理可有效抑制腐败微生物增殖，减缓低盐酱卤鸡胸肉腐败。

图3 维恩图Fig.3 Venn diagram

表5 细菌群落多样性指数Table 5 Bacterial community diversity index

2.4.2 贮藏期细菌菌群结构分析

由各取样点间共有菌群旭日图可知（见图4），在门水平上，对照组（a）和处理组（b）主要菌门均为 变 形 菌 门（Proteobacteria）、厚 壁 菌 门（Fir⁃micutes）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）和蓝藻门（Cyanobacteria）。其中，厚壁菌门和变形菌门为对照组腐败过程中绝对优势菌门。在属水平上，对照组相对含量大于1%菌属有13 个，相对含量大于10%优势菌属有3 个，包括气球菌属（Aerococcus，45.40%）、伯克氏菌属（Burkholderia，12.70%）、不 动 杆 菌 属（Acineto⁃bacter，11.70%），气球菌属为绝对优势菌属。而处理组中，各菌门比例分布相对平均，未见明显优势菌群。与对照组相比，处理组中厚壁菌门含量明显低，而相对含量大于1%菌属有17个，相对含量大于10%优势菌属有4 个，包括表皮菌属（Cuti⁃bacterium，14.80%）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter，13.80%）、不动杆菌属（Acinetobacter，12.10%）、伯克氏菌属（Burkholderia，11.20%）。气球菌属含量明显低于对照组。

图4 取样期内细菌群落分布旭日图Fig.4 Community analysis sunburst plot during sampling time

不同取样点间菌群属水平相对丰度变化如图5所示。处理组中主要菌群为伯克氏菌属、不动杆菌属、嗜冷杆菌属和表皮菌属，各菌群所占比例随时间变化较小。对照组中主要菌群为气球菌属、伯克氏菌属、不动杆菌属和嗜冷杆菌属，其中，0～6 d 内，各菌群所占比例随时间变化较小。值得注意的是，第6天和第8天，对照组中微生物较为单一，气球菌属成为绝对优势菌群，含量高达83%和99%，说明气球菌属是导致低盐酱卤鸡肉制品腐败的优势菌群。而处理组在取样期内气球菌属含量少于10%，且菌群分布稳定，中后期未出现明显优势菌，说明复配香辛料提取物可在一定程度上抑制低盐酱卤鸡肉中腐败菌繁殖，对延长其保鲜期具有积极作用。

图5 菌群属水平相对丰度图Fig.5 Relative abundance of microflora at genus level

3 讨论

本研究分析白芷、丁香、迷迭香、百里香、青花椒、红花椒等6种香辛料水提物和醇提物对低盐酱卤鸡胸肉中腐败菌抑制效果。结果显示，白芷、丁香和迷迭香提取液具有明显抑菌效果，且其醇提物优于水提物，可能是由于其提取物含有丁香酚乙酸酯、香芹酚、丁香酚、异硫氰酸烯内酯、枯茗醛、异冰片、百里酚、甲基子丁香酚、茴香脑、香芹酮等抑菌成分[13-14]。

TVB-N 是指动物性食品由于酶作用，在蛋白质分解过程中产生氨和胺等碱性含氮物质[15]，氨基酸分解代谢也是产生挥发性化合物主要途径[16]。将优化后复配香辛料提取液用于低盐酱卤鸡胸肉中，贮藏期内样品中TVB-N 上升减缓，总菌落数降低，可能原因是香辛料中有效成分抑制微生物增殖，抑制其对蛋白质的分解作用，减缓TVB-N值升高。Zorica等研究表明，鸡肉中添加罗勒和迷迭香精油，可有效减少沙门氏菌细胞数量[17]。曲颖等研究表明，丁香精油可有效抑制细菌和真菌生长繁殖[18]。钟丽等研究表明，白芷降低冷鲜猪肉中菌落总数[19]，与本试验结果一致。亦有研究表明，迷迭香、肉桂酸和丁香复合香辛料精油在抑制牛排蛋白质氧化、脂肪氧化及品质改善方面效果理想，保鲜效果良好[20]。酱卤鸡肉制品减盐化在一定程度上影响产品贮藏特性。本研究通过添加复合香辛料提取物，在保证低盐酱卤鸡肉制品货架期同时，打破传统工艺局限性，助益食品安全性、健康性，增强产品市场竞争力。

贮藏期菌相多样性指数分析表明，处理组每天Shannon、Ace数值比对照组高，而Simpson数值比对照组低，说明样品组细菌群落丰富度及多样性高于对照组，可能是仍检测出灭菌后香辛料提取液中死亡微生物基因，对结果造成干扰。样品菌群结构分析表明，气球菌属是导致低盐酱卤鸡胸肉腐败的优势菌属。研究表明，乳酸菌是主导富含蛋白质食品腐败的优势菌群，影响真空包装冷藏加工肉类和一些乳制品[21]。气球菌属为乳酸菌的一种，已被证实参与肉用卤水[22]、腊肠[23]、鲈鱼[24]、带鱼[25]、肠衣[26]、生牛奶[27]、未清洗鸡蛋[28]等多种肉制品、乳制品、蛋类的腐败变质。对比处理组和对照组菌群属水平相对丰度数据可知，前4 d 菌群结构接近，自第6 天始对照组菌群表现单一结构，气球菌属成为绝对优势菌属，而样品组菌群结构无明显变化，取样期内未表现出单一菌群结构，可能因对照组未加入保鲜剂，腐败菌成为优势菌群，样品腐败较早。即添加香辛料保鲜剂对于延长低盐酱卤鸡肉制品货架期效果明显。

综上，丁香醇提液0.02 g·mL-1、白芷醇提液0.05 g·mL-1和迷迭香醇提液0.15 g·mL-1对低盐酱卤鸡肉制品具有一定保鲜作用，使酱卤鸡肉制品减盐且不缩短甚至延长货架期成为可能。另外，气球菌属为腐败酱卤鸡肉优势菌群，是低盐酱卤鸡肉保质期限制因素，为今后研究低盐酱卤鸡肉制品保鲜提出新挑战。