LncRNA SNHG1 通过吸附miR-326 调控帕金森病发生、发展的作用机制

张辉芳 李富强 白银雪 韩燕 尹晓刚

（南阳医学高等专科学校第一附属医院神经内科,河南 南阳 473000）

帕金森病（PD）是一种常见于中老年的以静息性震颤、运动迟缓、痴呆、步态障碍和姿势不稳定为特征的神经系统变性疾病，其发病率在神经退行性疾病中位居第二，并有逐步上升趋势〔1〕。

PD 严重影响患者身心健康，并给社会造成沉重的经济负担。目前，虽已有多种药物进行PD 治疗的临床试验，但大多数药物的疗效并不理想〔2〕。长链非编码RNA（LncRNAs）是一类长度大于200个核苷酸的RNA 转录本，与机体的细胞周期调控等多种生物学过程有关〔3〕。越来越多的证据表明LncRNAs 参与了包括PD 在内的脑相关神经退行性疾病 的进展〔4，5〕。小核仁RNA 宿主基 因（SNHG）1 是新近发现的LncRNA，位于11q12.3染色体区域，其在多种癌症中的作用已被发现，主要发挥miRNA 分子海绵作用调控肿瘤发生〔6，7〕。Kraus 等〔8〕研究发现，PD 患者的大脑标本SNHG1表达明显上调。1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）可引起活性氧（ROS）形成，线粒体膜电位的改变，其诱导的SH-SY5Y 细胞是研究较透彻的经典PD细胞模型。在MPP+预处理的人神经母细胞瘤SHSY5Y 细胞中，SNHG1 表达也明显上调，过表达SNHG1 促进SH-SY5Y 细胞类包涵体样蛋白聚集并诱导细胞凋亡，对细胞具有毒性作用〔9〕。但SNHG1 在PD 作用机制尚未完全阐明。因此，本研究采用MPP+预处理SH-SY5Y 细胞构建PD 体外细胞模型，旨在探讨SNHG1 调控PD 发生发展的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 购自中科院上海细胞库；DMEM 培养液、胎牛血清、青霉素链霉素购自美国Gibco 公司；MPP+购自美国Sigma公司；LipofectamineTM2000 购自美国Invitrogen 公司；si-con、si-LncRNA SNHG1、miR-con、miR-326 mimics、anti-miR-con、anti-miR-326、WT-SNHG1 和 MUTSNHG1 的构建和测序及聚合酶链反应（PCR）引物均由生工生物工程股份有限公司提供；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自威格拉斯生物技术（北京）有限公司；总RNA 提取试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司；逆转录试剂盒购自美国Roche 公司；荧光试验试剂盒购自大连TaKaRa 生物技术有限公司；噻唑蓝（MTT）试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；RIPA 裂解液、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、Western封闭液、洗涤液、乳酸脱氨酶释放检测试剂盒购自上海碧云天公司；兔源细胞周期蛋白（Cyclin）D1 抗体、兔源B 细胞淋巴瘤（Bcl）-2 抗体、兔源Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）抗体、兔源酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-3 抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗购自美国Abcam 公司；鼠源β-actin 抗体购自美国Santa Cruz 公司。

1.2 细胞培养、转染和分组 采用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培养液培养SH-SY5Y 细胞，培养液中添加100 U/ml 的青霉素和100 μg/ml 的链霉素，培养条件:37℃，5% CO2。当细胞融合度约80%时，采用0.25% 的胰蛋白酶从瓶壁上分离细胞，进行传代，取传3 代的对数期细胞进行实验。细胞转染:将对数期SH-SY5Y 细胞2×105个/孔细胞数接种于6 孔板，当细胞融合度达到50%时，利用LipofectamineTM2000 参照其使用说明将si-con、si-LncRNA SNHG1 分别转染SH-SY5Y 细胞，培养48 h后，检测转染效率后进行后续分析。为进一步验证LncRNA SNHG1 是通过调控miR-326 表达进而调控MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞存活和凋亡，将si-LncRNA SNHG1 与anti-miR-326 或者anti-miR-con 共转染至SH-SY5Y 细胞，经4 mmol/L 的MPP+处理后，检测SH-SY5Y 细胞的存活和凋亡情况。细胞分组如下:NC 组（正常培养的SH-SY5Y 细胞）、MPP+组（4 mmol/L 的MPP+处理SH-SY5Y 细胞24 h 构建PD 的细胞模型）、MPP++si-con 组（转染si-con，用MPP+处理）、MPP++si-LncRNA SNHG1 组（转染si-LncRNA SNHG1，用MPP+处理）、MPP++miR-con 组（转染miR-con，用MPP+处理）、MPP++miR-326 组（转染miR-326 mimics）、MPP++si-LncRNA+antimiR-con 组（共转染si-LncRNA SNHG1 和anti-miRcon，用MPP+处理）和MPP++si-LncRNA+anti-miR-326 组（共转染si-LncRNA SNHG1 和anti-miR-326，用MPP+处理）。MPP+浓度及处理时间参照文献〔10〕进行。

1.3 qRT-PCR 检测 利用总RNA 提取试剂盒分别提取各组SH-SY5Y 细胞的总RNA，并检测其浓度和纯度。利用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，并以cDNA 为模板利用荧光试验试剂盒进行qPCR 扩增。用2-ΔΔCt法计算SNHG1 和miR-326 的相对表达量，分别以β-actin 和U6 为内参。引物序列如下（5＇-3＇）:U6:上游引物TCCGATCGTGAAGCGTTC，下游引物GTGCAGGGTCCGAGGT；miR-326:上游引物CCTCTGGGCCCTTCCTCCAG，下游引物GCTGTCAACGATACGCTACCTA；SNHG1:上游引物CCCCATGATGGTTCCTCAGTT，下游引物GGAAAGCAAGTGCAGGTTAGTC；β-actin:上游引物TATGCTCTCCCTCACGCCA，下游引物TTTACGGATGTCAACGTCACAC。

1.4 双荧光素酶报告基因检测 利用生物信息软件预测SNHG1 的靶基因。发现SNHG1 与miR-326能够部分特异性结合，猜测miR-326 是SNHG1 的靶基因，并进行验证。构建野生型WT-SNHG1 和突变型MUT-SNHG1 的SNHG1-3＇UTR 荧光素酶报告基因载体，利用LipofectamineTM2000 将miR-326 模拟物和miR-con 分别与WT-SNHG1 和MUT-SNHG1 共转染至SH-SY5Y 细胞，培养48 h 后，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定各组SH-SY5Y 细胞的荧光素酶活性。

1.5 MTT 比色法检测细胞活力 将SH-SY5Y 细胞按照2×103个/孔接种于96 孔板，按照1.2 细胞分组进行相应处理后，培养48 h 后，加入MTT 试剂（20 μl/孔），孵育4 h 后，弃去上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）（150 μl/孔），继续孵育2 h 直至结晶完全溶解，用酶标仪在490 nm 波长处检测各孔的OD 值，计算细胞存活率。

1.6 乳酸脱氢酶（LDH）释放量 将适量SH-SY5Y细胞接种到96 孔板中，使待检测时细胞密度约为70%。吸去培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）液洗涤1 次。更换为含1%血清DMEM 培养基按照1.2 进行分组和细胞处理，在预定的检测时间1 h 前，从培养箱取出培养板，在未经药物处理用于后续裂解的细胞孔加入体积为原有培养液10%的LDH 释放试剂，反复数次混匀，继续放入培养箱培养，到达时间后，细胞培养板离心后，分别取各孔的上清液120 μl，加入新的96 孔板相应孔中，随即进行样品测定。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组对数期SH-SY5Y 细胞，用预冷的PBS 液洗涤细胞，加入适量的1×结合缓冲液悬浮细胞，离心后弃上清。再次加入1×结合缓冲液悬浮细胞，使细胞浓度约为1×106个/ml，取100 μl 细胞悬液加入流式管内，加入5 μl的Annexin V-FITC，室温避光混匀10 min，加入5 μl的PI，室温避光孵育5 min 后，补加PBS 液至500 μl，轻轻混匀，30 min 内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.8 Western 印迹检测 采用RIPA 裂解液裂解各组SH-SY5Y 细胞，提取细胞蛋白，二喹啉甲酸（BCA）试剂盒进行蛋白定量。随后按照细胞蛋白变性-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶泳-转膜-封闭-洗膜-Ⅰ抗孵育-洗膜-Ⅱ抗孵育-ECL 显影-拍照-目的条带定量分析步骤进行（以β-actin 为内参）。

1.9 统计学方法 采用SPSS18.0 软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结果

2.1 MPP+处理SH-SY5Y 细胞对LncRNA SNHG1和miR-326 表达的影响 与NC 组比较，MPP+组SH-SY5 Y细胞LncRNASNHG1 的表达水平显著升高，miR-326 的表达水平显著降低（P＜0.05）。见表1。

表1 MPP+处理SH-SY5Y 细胞对LncRNA SNHG1 和miR-326 表达的影响(,n=9)

表1 MPP+处理SH-SY5Y 细胞对LncRNA SNHG1 和miR-326 表达的影响(,n=9)

2.2 沉默LncRNA SNHG1 对MPP+处理SH-SY5Y细胞存活的影响 与NC 组相比，MPP+组SH-SY5Y细胞LncRNA SNHG1 的表达水平显著升高，LDH 的释放量显著增加，CyclinD1 蛋白表达水平显著降低，细胞存活率显著降低（均P＜0.05）；与MPP++si-con组比较，MPP++si-LncRNA SNHG1 组SH-SY5Y 细胞LncRNA SNHG1 的表达水平显著降低，LDH 的释放量显著减少，CyclinD1 蛋白的表达水平显著升高，细胞存活率显著升高（均P＜0.05）。见图1，表2。

图1 Western 印迹检测CyclinD1 蛋白表达

表2 沉默LncRNA SNHG1 对MPP+处理SH-SY5Y 细胞存活及凋亡的影响(,n=9)

表2 沉默LncRNA SNHG1 对MPP+处理SH-SY5Y 细胞存活及凋亡的影响(,n=9)

与NC 组比较:1）P＜0.05；与MPP++si-con 组比较:2）P＜0.05

2.3 沉默LncRNA SNHG1 对MPP+处理SH-SY5Y细胞凋亡的影响 与NC 组相比，MPP+组SH-SY5Y细胞SH-SY5Y 细胞Bcl-2 表达水平显著降低，Bax和酶切caspase-3 表达水平显著升高，细胞凋亡率显著升高（均P＜0.05）；与MPP++si-con 组比较，MPP++si-LncRNA SNHG1 组SH-SY5Y 细胞Bcl-2 表达水平显著升高，Bax 和酶切caspase-3 表达水平显著降低，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。见表2、图2、图3。

图2 流式细胞术检测SH-SY5Y 细胞凋亡

图3 Western 印迹检测Bcl-2 蛋白、Bax 蛋白和酶切caspase-3 蛋白表达

2.4 LncRNA SNHG1 靶向调控miR-326 表达 生物信息学软件进行靶基因预测显示，见图4，LncRNA SNHG1 与miR-326 存在部分连续特异性结合位点。与miR-con 和WT-LncRNA SNHG1 共转染组相比，miR-326 和WT-LncRNA SNHG1 共转染组SHSY5Y 细胞的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；与miR-con 和MUT-LncRNA SNHG1 共转染组相比，miR-326 和MUT-LncRNA SNHG1 共转染组SHSY5Y 细胞的荧光素酶活性无明显变化（P＜0.05）。见表3。与si-con 组SH-SY5Y 细胞miR-326 的表达水平（1.00±0.12）相比，si-LncRNA SNHG1 组表达水平（4.16±0.63）显著升高（P＜0.05）；与pcDNA组SH-SY5Y 细胞miR-326 的表达水平（0.95±0.15）比较，pcDNA-LncRNA SNHG1 组表达水平（0.65±0.06）显著降低（P＜0.05）。提示，miR-326 是LncRNA SNHG1 的靶基因，LncRNA SNHG1 可靶向负性调控miR-326 的表达。

图4 LncRNA SNHG1 与miR-326 存在靶向位点

表3 双荧光素酶报告实验(,n=9)

表3 双荧光素酶报告实验(,n=9)

2.5 过表达miR-326 对MPP+处理SH-SY5Y 细胞存活和凋亡的影响 与NC 组相比，MPP+组SHSY5Y 细胞miR-326、CyclinD1 和Bcl-2 表达水平显著降低，Bax 表达水平显著升高（均P＜0.05），LDH释放量显著升高，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高；与MPP++miR-con 组相比，MPP++miR-326 组SH-SY5Y 细胞miR-326、CyclinD1 和Bcl-2 表达水平显著升高，Bax 表达水平显著降低，LDH 释放量显著降低，细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低（均P＜0.05）。见图5，表4。

表4 转染miR-326 增加MPP+处理SH-SY5Y 细胞存活抑制细胞凋亡(,n=9)

表4 转染miR-326 增加MPP+处理SH-SY5Y 细胞存活抑制细胞凋亡(,n=9)

与NC 组比较:1）P＜0.05；与MPP++miR-con 组比较:2）P＜0.05

图5 Western 印迹检测CyclinD1 蛋白、Bcl-2 蛋白、Bax 蛋白和酶切caspase-3 蛋白表达

2.6 抑制miR-326 逆转沉默LncRNA SNHG1 对MPP+处理SH-SY5Y 细胞存活和凋亡的影响 与MPP++si-con 组相比，MPP++si-LncRNA SNHG1 组SH-SY5Y 细胞miR-326、CyclinD1 和Bcl-2 表达水平显著升高，Bax 表达水平显著降低，LDH 释放量显著降低，细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）；与MPP++si-LncRNA+anti-miR-con 组相比，MPP++si-LncRNA+anti-miR-326 组SH-SY5Y 细胞miR-326、CyclinD1 和Bcl-2 表达水平显著降低，Bax 表达水平显著升高，LDH 释放量显著升高，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。见表5，图6。

图6 Western 印迹检测CyclinD1、Bcl-2、Bax 和酶切caspase-3 表达

表5 干扰miR-326 逆转沉默LncRNA SNHG1 对MPP+处理SH-SY5Y 细胞促进存活和抑制凋亡的作用(,n=9)

表5 干扰miR-326 逆转沉默LncRNA SNHG1 对MPP+处理SH-SY5Y 细胞促进存活和抑制凋亡的作用(,n=9)

与MPP++si-con 组比较:1）P＜0.05；与MPP++si-LncRNA SNHG1+anti-miR-con 组比较:2）P＜0.05

3 讨论

PD 是由于黑质多巴胺能神经元减少而引起的一种神经退行性疾病，多巴胺生成的逐渐丧失是PD的重要病理特征〔11〕。遗传、环境、生活方式等因素与PD 的发生密切相关。据统计，全球65 岁以上人群中PD 病率为1%～2%〔12〕。SNHG1 属于宿主核仁小分子RNA 家族成员之一，其在多种恶性肿瘤中的作用已被广泛报道。SNHG1 在PD 中的作用被逐渐揭示。研究发现，SNHG1 通过发挥miR-7 竞争性内源RNA 作用，上调NLRP3 表达，促进炎性小体活化，促进PD 神经炎症的发生〔13〕；Xie 等〔14〕研究发现，SNHG1 的上调增强了MPP+对诱导的SH-SY5Y细胞毒性，细胞活力降低，ROS 生成增加，同时伴有caspase-3 上调和细胞色素C 的释放；此外，SNHG1的上调还可促进MPP+对诱导的SH-SY5Y 细胞LDH的释放，而干扰SNHG1 则具有神经保护作用。LDH的释放量显著增加，Bax 和酶切caspase-3 蛋白表达增加，Bcl-2 和CyclinD1 蛋白的表达显著降低。进一步研究发现，沉默SNHG1 能够降低MPP+处理对SH-SY5Y 的细胞毒性，抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。提示SNHG1 参与PD 的进展。

已有研究报道SNHG1 通过发挥miRNA 分子海绵作用参与调控人类疾病的发生发展〔15〕。miR-326首次发现于神经元中，在Notch 通路抑制剂处理的斑马鱼胚胎中表达上调。既往研究表明，在PD 小鼠模型中，miR-326 的表达下调，过表达miR-326 通过抑制激肽释放酶（klk）7 介导的丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路，抑制PD 细胞凋亡，促进多巴胺能神经元增殖〔16〕；miR-326 靶向XBP1 通过JNK 信号抑制一氧化氮合酶表达，还可促进多巴胺能神经元的自噬〔17〕。此外，在阿尔茨海默病小鼠模型中，miR-326 负调控VAV1 的表达，抑制JNK 信号通路的激活，抑制阿尔茨海默病模型小鼠神经元凋亡〔18〕。本研究结果提示SNHG1 通过靶向miR-326抑制MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡，促进细胞存活。但LncRNA 调控网络复杂，SNHG1 可能通过调控miR-326/mRNA 分子轴发挥作用，miR-326 下游靶基因有待进一步研究。

综上，SNHG1 在MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞中表达上调，miR-326 表达下调，SNHG1 通过吸附miR-326 能够抑制MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡，减轻其对细胞的毒性作用。