转基因大豆GTS40-3-2对子代雄性大鼠主要器官和生殖机能的影响研究

史宗勇 刘 璇 路 超 郭俊佩 许冬梅 赵娟丽 袁建琴

(山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801)

大豆作为传统农作物，既是重要的食物原料，也是植物油和动物饲料蛋白的重要来源。因全球大豆需求旺盛，多年来，大豆一直是转基因品种推广面积最大的作物。2018年，全球种植转基因大豆9 590万公顷，占全球转基因作物种植总面积的50%，占全球大豆种植总面积的78%[1]。国内大豆产量无法满足市场需求，我国已成为大豆净进口国。2019年，我国进口大豆8 851 万吨，进口量远超其他作物[2]，且进口大豆几乎均为转基因大豆。转基因大豆GTS40-3-2由美国孟山都公司研发，运用基因枪介导转入cp4-epsps具有抗除草剂性状，我国批准其进口用作加工原料。然而，转基因作物自诞生以来，其安全性一直备受争议。因此，探究转基因作物对动物的潜在影响具有重要的现实意义。

全世界各国均制定了相应的转基因生物安全评价体系。我国主要从分子特征、环境安全和食用安全3个方面对转基因生物进行安全评价[3]。其中，食用安全性评价主要围绕营养成分分析和营养学评价、致敏性评价和毒理学评价展开[4]。当前国内外常用不同转基因材料饲喂大鼠[5-6]、小鼠[7]、罗非鱼[8]、山羊[9]等模型动物，研究动物体重增长、饲料利用率、脏器系数、血常规、血清化学、重要器官结构变化，多数研究认为喂食转基因饲料未对测试动物产生显著影响。睾酮作为哺乳动物最重要的雄性激素，由睾丸间质细胞合成和分泌，在雄性动物精子生成、性行为维持中发挥重要作用。睾丸间质细胞中睾酮的生物合成和分泌与葡萄糖摄取密切相关[10]。葡萄糖转运蛋白-8(glucose transporter 8,GLUT8)是重要的葡萄糖转运载体。提高该基因的表达水平，能增强细胞摄取葡萄糖的能力，增加睾丸间质细胞睾酮的合成与分泌[11]。转基因大豆对动物生殖系统影响研究主要集中在睾丸脏器系数、组织结构、生殖细胞和精子形态等方面[12-14]，鲜见其对雄性大鼠睾酮分泌的研究报道。本试验以长期喂食含有转基因大豆(GTS40-3-2)饲料的亲代大鼠繁殖获得子代大鼠，断乳后继续饲喂相同饲料，对喂食过程中子代雄鼠生长状况、主要器官发育和雄性激素睾酮合成必需蛋白GLUT8表达的影响进行测试，以探讨转基因大豆对子代雄性大鼠器官和生殖机能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物分组及处理 亲代30日龄健康SD大鼠购自山西医科大学实验动物中心(生产许可号：SCXK(晋)2015001)，其中雄性大鼠60只，雌性大鼠30只，按体重随机分为两组。条件为温度22～26℃，湿度50%～65%，12 h光照、12 h黑暗笼养，普通环境饲喂，取食、饮水自由。

试验组(GM组)喂食含转基因大豆(GTS40-3-2大豆)饲料，对照组(CK组)喂食含常规大豆(Soy-bean A5403大豆)饲料，试验大豆材料由农业农村部农作物生态环境安全监督检验测试中心(太原)提供。Soy-bean A5403大豆是转基因大豆GTS40-3-2的转化受体。组内雌雄分笼饲喂90 d后，同组雌雄大鼠交配，交配期、孕期及哺乳期各组母鼠继续给予相应饲料饲喂。

子代大鼠母乳喂养21 d后，各组每窝随机至多抽取2只雄性仔鼠，每组16只，各组子代大鼠继续喂食与亲本大鼠相同饲料，饲喂30、60、90 d后，各组分别随机选取5只大鼠用于本研究。

1.1.2 饲料 饲喂饲料委托山西医科大学实验动物中心加工，饲料根据大鼠常规饲料配方为基础配制(其中豆粕含量为20%)[15]，GM组饲料中豆粕全部为转基因大豆GTS40-3-2豆粕，CK组饲料中全部为Soy-bean A5403大豆豆粕。两种饲料除豆粕成分外其他成分一致，饲料主要营养成分符合《GB 14924.3-2010 实验动物配合饲料营养成分》[16]要求。

1.1.3 主要仪器 IQ5型实时荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；ELx808型酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；Neofuge 25R型台式高速冷冻离心机，香港力康发展有限公司；THUNDER-DM6B正置荧光显微镜，德国莱卡公司。

1.2 试验方法

试验期间，每天早中晚3次观察并记录大鼠的饮食饮水、精神状态等一般行为活动，特别关注大鼠皮毛、生殖器外观、粪便及死亡等异常表现。

1.2.1 脏器系数的测定 喂食子代大鼠30、60、90 d后，用颈椎脱臼法处死大鼠，称量体重，剪开体腔解剖，分别摘取睾丸、附睾、脑、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏和肾上腺，仔细剔除关联组织后称重，计算大鼠主要器官的脏器系数。

1.2.2 大体解剖及组织学检查 解剖时对脏器进行大体观察，摘取睾丸、附睾、肾和肺，用解剖剪将其修为5～8 mm的组织块，用10%甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水(85%、95%、100%)、二甲苯透明、石蜡包埋后制成6 μm厚组织切片，苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)封存，进行组织病理学检查。

1.2.3GLUT8基因表达RT-qPCR测定 采用Trizol法提取大鼠睾丸组织总RNA，并反转录获得cDNA，利用Primer Premier 5.0 设计实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)引物(表1)。按照试剂盒说明书，反转录获得cDNA，然后进行RT-qPCR反应。选用大鼠18SrRNA作为参照基因。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.2.4 GLUT8蛋白酶联免疫分析 室温融化冷冻保存的睾丸组织，用3～5℃预冷的pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)冲洗去除组织表面杂质。在4℃条件下小心剥除被膜结构，用无菌剪刀将组织剪碎称重，按1 g组织加入9 mL PBS溶液，匀浆处理形成均匀的组织溶液，3 000 r·min-1离心20 min，取上清分装，按照大鼠GLUT8酶联免疫分析试剂盒说明书操作，反应终止后立即用酶标仪进行检测，运用GEN5CHS2.01软件分析处理检测数据。

2 结果与分析

2.1 喂食转基因大豆对大鼠重要器官脏器系数的影响

由表2可知，饲喂期间两组大鼠睾丸、附睾、脑、心、肺、肝、脾、肾和肾上腺的脏器系数随着饲喂天数的延长而呈下降趋势。与CK组相比，饲喂30、90 d后9种器官脏器系数无显著差异(P>0.05)；饲喂60 d后，睾丸、脑、心、肝、脾、肾和肾上腺的脏器系数无显著差异(P>0.05)，而肺、附睾脏器系数存在显著差异(P<0.05)。

表2 转基因大豆对脏器系数的影响Table 2 Effects of GM soybeans on visceral coefficents of rat

2.2 喂食转基因大豆对大鼠重要器官组织结构的影响

饲喂子代雄性大鼠30、60、90 d后处死，摘取睾丸、附睾、肾脏和肺制做组织切片。镜检发现GM组和CK组各器官结构正常，无明显病理改变。

睾丸结构见图1，生精小管被膜为单层扁平上皮，横断面细胞排列紧密而规则，管壁可见不同发育阶段的生精细胞，且生精细胞没有明显的染色质浓缩和断裂；支持细胞呈高柱状，散在分布于各类生精细胞之间，轮廓依稀可辨；生精小管腔中均有精子存在。

附睾结构见图2，附睾管结构完整，管周组织含平滑肌细胞、结缔组织及毛细血管等结构。附睾管管壁外层基膜完整平滑；内层为假复层纤毛上皮，其中主细胞数量最多，细胞游离面微绒毛细长整齐，形成管腔面刷状缘；管腔内精液饱满，有大量精子，附睾管结构正常。

肾脏结构见图3，肾组织结构完整，肾小体清晰可见，断面为完整的圆形或卵圆形。毛细血管球位于肾小体中央，结构完好盘曲成簇；毛细血管管壁有肾小囊脏层包裹，其上足细胞细胞核染色清晰；肾小囊腔由脏层和壁层相互移行形成，肾小囊腔明显，无粘连、膨胀；肾小管管腔轮廓清晰，近端小管管腔较小，管壁上皮细胞结构正常，细胞游离面可见刷状缘；远端小管腔面规则，细胞排列紧密，核位于细胞中央或近腔面。

注：1：肾小囊壁层；2：肾小囊腔；3：足细胞；4：近端小管；5：远端小管。Note:1:Wall layer of renal small capsule.2:Renal capsule cavity.3:Podocyte.4:Proximal tubule.5:Distal tubule.图3 不同时期的肾组织学分析(×200)Fig.3 Histopathology analysis of kidney in different periods(×200)

肺结构见图4，肺组织结构完整，导气部结构清楚，细支气管界限清晰，管腔清楚无异物；换气部结构完整，呼吸性细支气管、肺泡管清晰通畅，无肺泡结构紊乱、肺泡上皮细胞降解、脱落等病理变化现象。

注：1：肺泡管；2：肺泡；3：呼吸性细支气管；4：肺泡囊；5：细支气管。Note:1:Alveolar duct.2:Alveoli.3:Respiratory bronchioles.4:Alveolar sacs.5:Bronchioles.图4 不同时期的肺组织学分析(×50)Fig.4 Histopathology analysis of lungs in different periods(×50)

2.3 喂食转基因大豆对大鼠睾丸GLUT8基因表达的影响

采用相对定量法(2-ΔΔCT)分析RT-qPCR数据[17]，由图5-A可知，与CK组相比，GM组大鼠GLUT8基因转录水平未发生显著变化(P>0.05)。表明饲料中转基因大豆成分对子代大鼠睾丸GLUT8基因转录水平无显著影响。

为了进一步确定GLUT8蛋白的积累量，对该蛋白进行了酶联免疫分析。根据标准品系列数据，用GEN5CHS 2.01软件，获得线性回归方程(y=0.475 6x-0.083 6，R2=1)。用该曲线计算样品中GLUT8蛋白的含量(图5-B)，结果显示相同饲喂天数GM组和CK组无显著差异(P>0.05)，与转录水平结果一致。表明喂食转基因大豆对大鼠睾丸中GLUT8蛋白含量无显著影响。

注：A：转录水平；B：蛋白水平。Note:A:Transcription level.B:GLUT8 protein level.图5 转基因大豆成分对大鼠GLUT8表达的影响Fig.5 Effect of transgenic soybean components on the expression of GLUT8 in rats

3 讨论

3.1 喂食转基因大豆对大鼠重要器官的影响

动物脏器重量、相关系数及组织结构的变化能够体现饲料成分对脏器的影响，反映动物的真实状态，有研究表明转基因大豆对动物脏器系数生长、体重、摄食等方面无不良影响[18-21]，在标准化饲养条件下，解剖可见两组大鼠主要器官形态、颜色正常，器官间比例协调、大小适中。试验大鼠脏器系数均随饲喂天数的延长而降低，说明试验期间动物体重增长幅度超过单一脏器的增长幅度，符合动物生长发育规律，与王尧等[22]报道结果相似。本研究发现饲喂30、60、90 d，GM组与CK组大鼠的9种(睾丸、附睾、脑、心、肺、肝、脾、肾、肾上腺)器官脏器系数的27组数据中，仅饲喂60 d的附睾和肺脏器系数差异显著(P<0.05)，但未发现大鼠肺、附睾增生、水肿、充血或萎缩等退行性改变，且试验所测脏器系数数值均处于董延生等[23]确立的SD雄性大鼠脏器系数正常参考值(95% CI)范围内。显著差异可能由动物个体差异或中空管腔样器官材料处理偏差造成，无生物学意义。

器官结构是其生理功能正常发挥的物质基础，研究选择睾丸、附睾、肾、肺4种器官制作组织切片，镜检显示各器官结构完整，细胞形态、分布正常，未发现明显病理改变，表明多代喂食转基因大豆不会对子代雄鼠主要器官造成明显病理损伤。Battistelli等[24]研究表明长期喂食含转基因大豆饲料不会导致小鼠消化道上皮结构改变。刘燕等[25]用转基因大豆中作J9331喂养鹌鹑90 d，光镜下未发现鹌鹑心、肺等14种器官组织呈现实质细胞变性坏死等不良反应。Snell等[26]收集12项长期研究和12项多代研究数据，分析得出长期饲喂转基因饲料不会引起动物组织器官病理改变。

3.2 喂食转基因大豆对大鼠生殖机能的影响

睾丸作为精子生成和雄性激素分泌的场所，是雄性哺乳动物最重要的生殖器官，饲料成分对睾丸结构和功能的影响是转基因生物安全评价的重要内容。芦春斌等[12-14]研究表明转基因大豆对小鼠无不良影响，睾丸组织结构正常，染色体结构完整，不会使小鼠的睾丸组织细胞发生凋亡和病理损伤，也不会对小鼠精子的顶体结构和顶体反应能力造成影响。严红实等[27]通过精子畸形和骨髓微核试验发现，抗疫霉根腐病转基因大豆B3W1009、抗食叶性害虫转基因大豆AK8059、高油酸转基因大豆E2D8037和EB8011四种转基因大豆与两种亲本大豆对精子畸变影响无显著性差异。Brake等[28]连续喂食亲代大鼠抗草甘膦大豆，检测子一代胎鼠、出生后、青春期及成年各阶段睾丸发育情况，结果未发现显著影响。

本研究针对雄性动物的主要性激素睾酮合成过程的限速因素进行研究，从睾酮合成能量供应、调节因子和原料转运三个维度探讨转基因大豆对雄鼠睾酮合成的影响，对试验条件下GLUT8基因的表达情况进行测定，发现在CK组与GM组，各处理时间组间均无显著性差异，且转录水平和蛋白水平结果一致。芦春斌等[29]喂食转基因大豆未发现对子代雄鼠精子质量和组织病理造成影响，与本研究结果一致。本研究前期发现饲料中转基因大豆成分对亲代雄性大鼠精子畸变[30]、睾丸结构[31]和类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)的表达[32]均无明显影响。美国国家研究委员会(US National Research Council)自2002年开始调查商业化转基因作物，至今未发现其对人类健康和环境有害[33]。Nicolia等[34]综合分析全球1 783项转基因作物研究报告，得出转基因作物对人类和动物无害的结论。综合分析表明转基因大豆对雄性大鼠生殖机能无明显影响。

4 结论

本研究通过对子代雄性大鼠持续喂食转基因大豆饲料，发现试验大鼠日常生长发育、体形外貌、妊娠等生理行为，睾丸、附睾等主要器官系数、组织结构，睾丸间质细胞雄性激素合成能量转运蛋白GLUT8的表达，均未受到饲料中转基因大豆的影响。表明转基因大豆GTS40-3-2成分在试验周期内对子代雄性大鼠的主要器官和生殖机能无不良影响。本研究结果为转基因大豆食用安全性评价提供了科学依据，同时表明转基因技术在作物育种、种质资源改良和保障粮食安全等方面具有重大应用价值。