透明质酸寡糖软膏的制备及药效学研究

许放，王洪新，郭斌

(1.锦州医科大学附属第三医院；2.锦州医科大学，辽宁 锦州 121000)

透明质酸(hyaluronic，HA)是一种由葡糖醛酸和N—乙酰氨基葡糖的双糖单位重复连接构成的酸性黏多糖。HA通过降解可以得到O-HA，酶解法是制备透明质酸寡糖最温和的降解方法[1]。HA寡糖是相对分子质量<10 000、单糖残基数为2～40(一般为4～16)的HA分子片段[2]，属于小分子多糖，其性质与普通透明质酸有很大不同，甚至具有完全相反的作用。其生物活性主要有促血管生成、促进创伤愈合、抗肿瘤及免疫调节等。目前有关透明质酸寡糖在伤口愈合中的作用研究较少，本研究通过形态学及组织学的观察，证实了透明质酸寡糖对伤口愈合的作用，为透明质酸寡糖的临床应用提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物：新西兰大耳白兔，2～3 kg锦州医科大学动物实验中心提供。

1.1.2 主要试剂：透明质酸寡糖(纯度≥95%，分子量758.63)，山东省药学科学实验室自制。液体石蜡，天津市大茂试剂厂。硬脂酸，天津永晟精细化工有限公司。黄凡士林，南昌华鑫医药化工有限公司。十二烷基硫酸钠，天津市光复精细化工研究所。丙三醇，天津永晟精细化工有限公司。尼泊金甲酯，浙江圣效化学品有限公司。羊毛脂，三乙醇胺，天津市致远化学试剂有限公司。TGF-β一抗，即用型SABC--POD二抗试剂盒，DAB显色试剂盒武汉博士德生物工程有限公司。积雪苷霜软膏(国药准字Z3102056，批号20180731，上海现代制药股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 软膏制备方法

1.2.1.1 软膏基质筛选[3-4]

表1 软膏基础处方筛选

1.2.1.2 正交试验因素与水平的确定：由以上实验得出结论，配方2为最适宜软膏基质。根据文献和预实验结果[5]，确定考察因素为单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、液体石蜡，选用L9(33)正交表进行试验。评价指标[6]分别为软膏的外观(占总分的40%)，分层时间(占总分的20%)，耐寒耐热稳定性(占总分的20%)。按照正交试验结果确定软膏基质处方为试验7。正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交试验设计与结果

表3 方差分析结果

1.2.1.3 制备工艺：取黄凡士林2.00 g、硬脂酸2.10 g、单硬脂酸甘油酯1.60 g、液状石蜡2.50 g水浴加热至75 ℃，制成油相，再取甘油2.00 g、十二烷基硫酸钠0.20 g、尼泊金甲酯0.02 g、蒸馏水9.60 mL加热至85 ℃，制成水相，将透明质酸寡糖0.06 g加入水相，搅拌使溶解。然后将水相混合液缓缓加到油相缓冲液中，边加边搅拌，冷凝，即得透明质酸寡糖软膏。

1.2.2 药效学分析方法

1.2.2.1 动物模型制作[7]：将新西兰大耳白兔经腹腔注射水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg)，麻醉显效后，剔除毛发，常规消毒，于每只兔耳腹侧面同一部位画出直径为1 cm的圆，并切除圆内皮肤，保留软骨膜及软骨。

造模后每只实验动物肌注青霉素4000 U，每日1次，注射2次。造模后即开始用药，12只动物随机分成6组，每组2只，分别涂以透明质酸寡糖软膏高浓度、中浓度、低浓度、积雪苷霜软膏、基质，其中每组有1只兔耳作为空白对照。伤口每天酒精消毒后换药，每日3次，每只兔分笼饲养。

1.2.2.2 伤口愈合评价[8-9]：其中6只兔分别于造模当天及造模后的第3、7、14天，对各个创面进行拍照，以图像分析软件Image-pro-plus 4.5处理图片，得出每个伤口愈合面积，从而计算伤口愈合率，伤口愈合率 =〔(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积〕×100%。剩余6只兔分别于建模后的第3、7、14天，创伤组织局部取材，常规固定、包埋、切片经 HE 染色。

1.2.2.3 免疫组织化学染色：应用SABC免疫组织化学方法，石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育15 min后进行高压抗原修复。滴加5%封闭血清孵育10～15 min，甩去，不需洗涤。兔抗兔TGF-β1、生物素标记的山羊抗兔二抗工作液37 ℃孵育10～30 min，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，步骤同上。每组切片随机抽取8个高倍镜视野(×400)，用 Image-ProPlus Version 6.0图像分析软件测定平均光密度值，取均值。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 实验创面肉眼观察

造模后各组创面见少量渗血，第1、2天，各组创面均无明显变化，创面周围略肿。第4天，空白对照组仍无明显变化，有少量渗出液。各浓度透明质酸寡糖软膏组及阳性药物组出现淡黄色分泌物，创面出现收缩。第7天，高浓度透明质酸寡糖组创面红润，创周结痂，创面收缩速度明显快于其他组，空白组伤口收缩不明显。第14天，各浓度透明质酸寡糖软膏组及阳性药物组创面干燥，创周有轻微瘢痕，其中高浓度组创面愈合面积明显大于其他组，空白组创面边缘有收缩，但仍有大部分未愈合。

2.2 创面愈合率 见表4。

表4 各组各时间点伤口愈合率比较

2.3 组织学观察

造模后第1、2天，6组伤口肉芽组织增生较少，6组之间比较未见明显差异。造模后第7天，高浓度透明质酸寡糖软膏组肉芽组织增生程度明显高于其他组，空白组上皮增生不明显，造模后第14天，各浓度透明质酸寡糖组及阳性药物组有较多肉芽组织形成，创面内可见大量新生血管生长，新生组织细胞排列紧密，空白组表皮仍有缺损，高浓度透明质酸寡糖组愈合效果优于其他组，见图1。

高浓度组(第14天) 中浓度组(第14天) 低浓度组(第14天)

2.4 TGF-β蛋白质免疫组化结果

TGF-β蛋白质阳性表达胞浆呈现棕黄色。高、中、低浓度组、阳性药物组和基质组TGF-β蛋白质平均光密度值比较差异具有统计学意义，说明高、中、低浓度组、阳性药物组对创面愈合都有作用。TGF-β在第14天表达最高，基质组略有TGF-β蛋白质阳性表达，但和空白组比较，无显著性差异，排除了空白组对创面愈合的干扰，见表5、图2。

表5 各组TGF-β蛋白质免疫组化结果

高浓度组(第14天) 中浓度组(第14天) 低浓度组(第14天)

3 讨 论

由于工业、农业、交通业及体育事业的高速发展，各种事故所造成的创伤日趋增多。创伤不仅发生率高，而且程度差别很大，伤情可以严重而复杂，甚至危及伤员的生命。创伤同心血管疾病及癌症已成为目前造成死亡的三大原因，如何有效促进伤口愈合是当今医学界亟待解决的问题。本研究主要是考察透明质酸寡糖在制备成软膏剂型后在伤口愈合方面的功效。

伤口愈合是一个复杂的过程，涉及多种细胞以及生长因子的相互作用,包括炎症阶段，增殖阶段，组织重塑阶段[10]。其中TGF-β的作用受到越来越多的重视。

对于皮肤缺损模型，在造模后肌注青霉素属常规预防操作，青霉素本身对伤口愈合无作用，对各实验组无影响。伤口愈合过程伴随着肉芽组织增生及伤口面积的减小，通过测量伤口面积的大小，计算伤口愈合率可以评价其对伤口愈合作用的快慢[11]。本研究通过比较3种不同浓度的透明质酸寡糖软膏组、阳性药物组、基质组以及空白组的伤口愈合率，可以看出在伤口愈合早期(1～2 d),各组间差异不明显，创面以充血为主。在伤口愈合中期(5～7 d)，透明质酸高浓度组的伤口愈合明显快于其他组，可能与透明质酸寡糖促进血管生成的作用有关[12]。在伤口愈合后期，空白组的愈合速度明显慢于其他组。

通过组织学的观察，在伤口愈合中期，不同浓度的透明质酸寡糖组及阳性药物组肉芽组织增生较多，新生血管增多，这是促进伤口愈合的原因。通过此研究发现透明质酸寡糖软膏确实有促进伤口愈合的作用。