AR患者外周血中Th17细胞表面程序性细胞死亡受体-1的表达变化

柳先知，翟亚莉，陈冬

(1.锦州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科，辽宁 锦州 121000；2.商丘市第三人民医院耳鼻咽喉科，河南 商丘 476000)

过敏性鼻炎(AR)是指机体接触过敏原后由免疫球蛋E(IgE)为主要介导的鼻部变态反应性疾病，主要表现有鼻塞、鼻痒、连续性打喷嚏及大量水样涕[1]。目前AR的全球患病率约为10%～25%，对人们的生活质量及健康产生重大影响，已成为各国亟待解决的全球性社会问题。AR主要是一种 I 型变态反应性疾病，传统观念认为Th1/Th2细胞免疫失衡在AR的发病机制中起着重要的作用[2]，而近年来研究发现，其他辅助性T细胞如Th17 细胞及其分泌的细胞因子在以Th2细胞免疫反应占优势的过敏性炎症中也发挥了重要作用，调节Th1/Th2细胞平衡[3]。

程序性死亡受体-1(programmed cell death-l，PD-1)是近来发现的B7-CD28 超家族的一员，主要是负性共刺激信号，对T细胞的失活及凋亡状态进行精细调控，可以直接抑制致病性效应T细胞[4]。有研究表明Th17细胞数量受其表面因子调控，PD-1是其中最重要的负性调控因子之一，PD-1负调节Th17细胞，其在自身免疫性疾病和过敏性疾病中发挥致病作用[5-6]。然而关于Th17细胞表面的PD-1的表达变化在AR中研究甚少。

本研究旨在应用流式细胞术检测PD-1在Th17细胞表面的表达水平及Th17的细胞比例变化，研究AR中Th17 细胞的变化情况及其表面PD-1表达水平的变化。

1 材料和方法

1.1 一般资料

选取于锦州医科大学附属第一医院就诊的过敏性鼻炎患者30例为实验组，健康者20例为对照组，所选研究对象需符合以下纳入和排除标准，签署知情同意书，并经锦州医科大学附属第一医院伦理委员会同意备案。

纳入标准：(1)AR组：符合中国过敏性鼻炎诊治指南(2018年)[7]诊断标准的过敏性鼻炎患者；(2)HC组：不符合上述诊断标准的健康人员。

排除标准：(1)近1个月内患有呼吸道感染性疾病者；(2)近2周内服用过免疫抑制剂、抗组胺药或糖皮质激素等抗过敏药物者；(3)患结核、肝炎等传染性疾病、严重的血液系统疾病及其他全身性疾病者。

1.2 主要实验试剂及仪器

Cell Activation Cocktail(withBrefeldin A)，APC-Cy7 anti-human CD4，Brilliant Violet 421 anti-human IL-17A，Brilliant Violet 510 anti-human CD127(IL-7Ra)，PE anti-human CD279(PD-1)，PE Mouse IgG1 κisotype Ctrl，APC Mouse IgG1 κ isotype Ctrl以上试剂均购自美国Biolegend有限公司。FACS Verse(3-laser,8color)流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 密度梯度离心法分离PBMC：患者和健康对照者均抽取2 mL EDTA抗凝外周血，混匀抗凝。将外周静脉血应用密度梯度离心法提取单个核细胞(PBMC),对PBMC进行台盼蓝染色和细胞计数。

1.3.2 PD-1标记的Th17细胞(CD4+IL-17A+)的荧光抗体染色：标记流式管，加入PBMC悬液100 μL，各流式管分别加入3 μL Fc Receptor Blocking Solution，室温避光孵育15 min。管中以2 μL/mL分别计算加入细胞刺激剂Cell Activation Cocktail(with Brefeldin A)，于37 ℃，5% CO2环境孵育5 h。孵育结束后，取出各流式管，分别加入APC-Cy7-anti-humanCD4，PE-anti-human PD-1各5 μL，轻弹管壁混匀，室温避光孵育15 min。孵育结束后加入1 mL 1×PBS重悬细胞，室温1400 rpm×5 min洗涤1次，弃上清液。分别加入200 μL 1×Cytofix/Cytoperm，4 ℃ 孵育20 min。结束后加入1 mL Perm/Wash重悬细胞，室温3000 rpm ×5 min洗涤1次，弃上清。加入BV421-anti-human IL-17A 抗体，4 ℃避光30 min。结束后加入1 mL 1×PBS，室温1400 rpm×5 min洗涤1次，弃上清液。流式细胞仪检测。

四色标记样本检测之前，需设置空白对照、各荧光抗体单标对照组和同型对照，对照组包括：(1)空白对照：不加任何荧光抗体；(2)APC-Cy7-anti-humanCD4单标：只加入 APC-Cy7-anti-humanCD4 荧光抗体；(3)BV421-anti-human IL-17A单标：只加入BV421-anti-human IL-17A 荧光抗体；(4)PE-anti-human PD-1 单标：只加入 PE-anti-human PD-1 荧光抗体；(5)同型对照：PD-1的同型抗体PE Mouse IgG1 κ isotype Ctrl，余抗体正常添加(所有对照组样本按照四色标记样本操作流程依次进行)。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 AR组与HC组的临床资料比较

AR组中男性为12例，女性为18例；HC组中男性为8例，女性为12例，年龄均在15～68岁，两组在年龄及性别方面的比较，均无统计学差异(P>0.05)，结果见表1。

表1 AR组和HC组的临床资料比较

2.2 AR组与HC组外周血中Th17细胞的比例变化

采用流式细胞技术检测 AR组和HC组外周血中Th17细胞数量百分比。AR组 Th17(CD4+IL-17A+)细胞百分比(中位值M=2.51%)较 HC 组(中位值M=1.13%)升高(P<0.001，图1)。

·为数据离群值

2.3 PD-1在AR组和HC组外周血Th17细胞表面的表达

采用流式细胞技术检测 AR组和HC组外周血中Th17细胞表面PD-1的表达水平，与HC健康对照组相比，AR患者中Th17细胞表面PD-1表达降低(Z=-5.941，P<0.05)，差异具有统计学意义。典型流式细胞仪检测结果见图2、图3、表2。

表2 HC组与AR组实验数据比较汇总表

流式细胞技术检测CD4+ IL-17A+ T 细胞占 CD4+ T细胞的百分比，PD-1+的CD4 + IL-17A + Th17 细胞分别占 CD4 +IL-17A +Th17细胞总数的百分比；A：P1 门内包含所有的外周血淋巴细胞；B：P2门内包含所有的CD4+T细 胞；C(HC组)和D(AR组)：P3门内包含所有的Th17(CD4+ IL-17A+)细胞；E(HC组)：为PD-1+ Th17(CD4+ IL-17A+)细胞占Th17(CD4+ IL-17A+)细胞的百分比；F(AR组)：PD-1+Th17(CD4+ IL-17A+)细胞占 Th17(CD4+ IL-17A+)细胞的百分比

图3 PD-1在Th17细胞表达水平的比较

2.4 在AR组中进行PD-1与Th17细胞的Sperman相关性分析

AR患者中PD-1与Th17(图4，r=-0.623，P<0.001)细胞比例呈负相关。

图4 PD-1与Th17细胞百分比的相关散点图

3 讨 论

过敏性鼻炎被认为是各种炎症介质、细胞因子、趋化因子、神经肽，以及粘附分子和细胞等形成的一个复杂的网络共同体，而引起的特异性、非特异性的鼻黏膜高反应的变应性疾病。经典研究认为Th1和Th2细胞应答的免疫失衡是变应性气道炎症的发病机理的中心[8]。新近发现的Th17细胞是区别于Th1和Th2 细胞的不同亚型，在过敏及自身免疫性疾病的免疫失衡中发挥重大作用。有研究发现过度增加的Th17细胞数目或Th17功能过度活化将激发变应性疾病(包含过敏性鼻炎和哮喘)的发生与发展[9]，我们的研究结果也证明在Th17细胞在AR发病机制中有着至关重要的作用，进一步观察了Th17细胞表面的PD-1在AR患者外周血中的表达变化，为阐明AR患者Th17细胞免疫失衡的调控因子提供了实验依据。

AR实验组中Th17细胞比例增加和过度活化。既往研究表明，Th17细胞是具有优先合成IL-17家族细胞因子(尤其是IL-7A和IL-17E)的新型CD4+T亚型，它们被认为在炎性疾病的发病机理中起着至关重要的作用[10-11]。Liu Y等人的研究结果表明在卵清蛋白或屋尘螨诱导的AR鼠模型的鼻灌洗液中，发现IL-17A水平和Th17细胞频率升高[12]。这些发现表明Th17细胞免疫失衡与AR发病机制密切相关。

本研究证实在AR中Th17细胞数量增加，其表面PD-1表达降低，PD-1表达水平与Th17细胞数量呈负相关，PD-1为负性调节因子，可促进细胞凋亡，对免疫耐受系统进行精细调控。Th17细胞上PD-1表达水平下降，可导致PD-1对Th17细胞增殖的抑制作用减弱，即Th17细胞增殖能力增加，导致其分泌的细胞因子产生变化，引起免疫功能失衡[13]。因此，在AR中，存在Th17细胞免疫失衡以及PD-1表达异常。

本实验结果提示AR患者外周血中PD-1 在Th17 细胞表面的表达水平明显减少。而这一研究结果同L Yang研究的自身免疫性关节炎结果相似，其研究还观察到PD-1与配体结合后，通过抑制PI3K/AKT通路的活性抑制Th17的免疫应答功能[14]。McAlees[15]对哮喘小鼠模型的研究中，在阻断PD-1后，可以增加Th17细胞的免疫应答反应，从而增加了动物模型的气道高反应性。在过敏性哮喘中发现Th1、Th17分化主要由mTORC1支持，T细胞的活化遵循经典的mTOR途径并且依赖PI3K/AKT路径，因此，PD-1可能通过直接抑制mTORC1而影响Th17细胞的分化[16-17]。

我们推测Th17细胞表面的PD-1作为共刺激因子参与AR的发病机制，但是其具体作用机制还不甚清楚，仍需做进一步探究。