经圆窗径路导入正庚醇建立老年性聋模型的实验研究

李里，史素楠，赵俊玲，宫亮

(1.锦州医科大学附属第一医院风湿免疫科；2.锦州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科，辽宁 锦州 121000)

耳聋是常见病，它可以影响人类交流。我国的耳聋发病人数位于主要致残疾病之首，发病人口超过2000万，感音神经性聋是耳聋发病主要原因。由于耳蜗毛细胞在哺乳动物不可再生，故耳聋尚且没有好的治疗方式。佩戴助听器电子人工耳蜗植入是目前主要的有限的治疗方式，而这两种方式的治疗价格较贵，大众难以接受。这些都影响了耳聋患者的治疗和听力改善。尤其是老年性聋，其可以导致交流障碍、社会孤立状态、劳动能力下降，这些都会造成社会巨大的负担。

老年性聋又称年龄相关性听力损失，是由于耳蜗结构和中枢听觉传导通路的进行性退化而导致的一种与年龄相关的渐进性双耳听力和言语辨别能力下降[1]。世界卫生组织(WHO)统计结果表明老年性耳聋居老年人听力减退原因之首[2]。随着人口老龄化的加速，老年性聋发病率逐年上升，然而目前关于老年性聋的病理机制尚不完全清楚[3-4]。小鼠是最早被应用于进化、发育、疾病等遗传学方面研究的动物模型。小鼠内耳的结构和功能与人类内耳结构和功能十分相似,因此对小鼠耳聋的研究可为人类耳聋的发病机制提供参考[5]。本实验拟将正庚醇通过耳后圆窗径路缓慢导入小鼠的内耳，旨在建立一种快速安全的老年性耳聋模型。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

SmartEP&OAE听觉诱发电位-耳声发射记录系统(美国IHS公司)、手术显微镜(德国Leica公司)、98%正庚醇(上海麦克林生化科技有限公司)、磨钻、脑电定位仪。

1.2 实验动物

健康且听力正常的4周龄C57BL/6Cnc小鼠30只，雄性，16～20 g(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，随机分成两组，对照组：15只，经耳后圆窗径路缓慢导入0.9%氯化钠注射液5 μL;实验组：15只，经耳后圆窗径路缓慢导入正庚醇5 μL。

1.3 实验方法

1.3.1 手术操作：腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和噻拉嗪(10 mg/kg)麻醉小鼠后，取左耳朝上侧卧位，左侧耳周备皮、消毒、铺无菌纱布，手术显微镜低倍镜下沿术耳耳根部下方2 mm处横行切开皮肤及皮下组织，切口长约1～1.5 cm，钝性分离软组织，自制牵开器牵开术区，暴露面神经和胸锁乳突肌，将胸锁乳突肌向尾侧分离暴露听泡，高倍镜下分离听泡后壁软组织，用磨钻于听泡尾侧上方钻开骨壁，钻孔直径约0.5 mm，暴露镫骨动脉及圆窗[6]。脑电定位仪固定改装的5 μL微量注射器，通过钻孔将5 μL液体缓慢注入听泡内，全层对位缝合软组织及皮肤。手术过程中注意保持圆窗膜的完整性。术后37 ℃恒温垫复苏。所有实验动物均以左耳为术耳，右耳为自身对照耳。

1.3.2 听性脑干诱发电位(ABR)测试：分别于术前3天、术后2小时、术后1天、术后3天行ABR检测。所有小鼠术前ABR阈值≤25 dB SPL作为纳入标准。术后3 d内各频率ABR阈移≥20 dB SPL作为造模成功的标准。各频率ABR阈值取平均值即为ABR平均阈值。

全身麻醉后，小鼠俯卧于隔音室测试台上，电极正极置于颅顶正中皮下,负极连接被测耳,接地电极连接对侧耳。SmartEP&OAE听觉诱发电位-耳声发射记录系统给予短纯音(tone burst)刺激,刺激声经插入式耳塞给入，选取12 kHz、32 kHz 2个频率分别进行测试并记录ABR阈值。重复率39.1 beats/s,带通滤波100～3000 Hz,叠加1024次,扫描时程16.0 ms[7]。声刺激强度从80 dB SPL开始,以10 dB逐次递减,接近听阈时以5 dB递减，最后一次出现Ⅰ波并与上一波形有延续性的声强数值定为ABR阈值，至少重复3次。同一刺激频率下给药前后的听阈差值记为ABR阈移。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 耳后圆窗径路导入正庚醇手术

各组小鼠无死亡,实验组有2只术后3天ABR阈移<20 dB SPL。所有手术小鼠无耳道流脓、红肿等感染迹象，无歪头、行走不稳等前庭功能受损表现，见图1。

A:耳下切口位置；B：寻找听泡的解剖标志：1.面神经，2.听泡，3.胸锁乳突肌；C：钻口(给药入口)

2.2 ABR检查

所有小鼠非手术耳ABR平均阈值差异有统计学意义(P<0.05)，对照组小鼠术耳手术前后各时间点听力无明显改变(P>0.05)，实验组小鼠术耳手术后ABR平均阈值显著升高，并随时间推移呈逐渐增高的趋势，差异有统计学意义(P<0.05),见表1、图2。同一时间点实验组小鼠32 kHz频率ABR平均阈值高于12 kHz ABR平均阈值，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

表1 各组小鼠术耳ABR平均阈值(dB SPL，n=15)

图2 实验组小鼠术耳不同时间点ABR平均听阈

图3 实验组小鼠术耳同一时间点各频率ABR平均听阈

3 讨 论

随着人口进入老龄化，老年性聋发病逐渐增高。在老年人中，感音神经性聋最为常见，是老年人导致耳聋最主要的原因。由于听力的丧失，老年人在生活中的正常交流受限，长期交流不畅，会造成老年人精神和心理压力，久而久之导致发病。老年性聋主要表现为两侧对称慢性进展的听力丧失，为感音神经性聋，其中以损伤高频听力为主。还有一部分患者主要以言语识别功能下降为主要表现。老年性聋的主要病理分型为感音型、神经型、代谢型或血管型、耳蜗传导型、中枢型和混合型共六型。目前对于老年性聋的机制研究主要有线粒体突变、氧化应激反应、炎症、细胞凋亡等多方面。而老年性聋在治疗方面，并没有很大进展，目前主要治疗方式为人工耳蜗，人工中耳及助听器。目前基因靶向治疗，干细胞移植等治疗也取得一定进展。

老年性聋定义为由于年龄相关性退化而导致的进行性、双侧、对称性听力损失[8-9]，其最终发病机制是多因素共同致病的结果，总体而言，内耳细胞的变性和缺失是老年性聋的主要原因，它包括感觉毛细胞、螺旋神经节、内耳侧壁血管纹及纤维细胞等非感觉细胞[10-13]。

既往认为耳蜗毛细胞变性和缺失是其主要病理类型，近年来越来越多研究表明代谢型聋即血管纹和螺旋韧带的萎缩以及耳蜗内电位(EP)降低是该疾病发生的重要因素[14-15]。

人和鼠的听觉系统相似,小鼠的基因组与人类基因组有很大的同源性,能引起小鼠耳聋的基因可能在人类中也存在类似的基因。所以，国内外被广泛应用于老年性耳聋研究的实验动物以小鼠居多，如CBA、C57BL/Cnc、BLAB/c等。据本实验组了解，目前国内CBA小鼠大多是冷冻胚胎，需胚胎复苏后慢慢饲养，价钱昂贵，成本巨大。大量文献报道C57BL/6Cnc小鼠携带Ahl基因，具有典型的AHL特征[16]，故本实验选用C57BL/Cnc小鼠为实验动物。

据了解，现已经有多种小鼠耳聋模型，如噪声暴露、耳毒性药物损伤、电离辐射等，但没有任何理想的模型可以快速、安全、靶向地对耳蜗造成损伤[10，15]e97389，659-655。我们成功经耳后圆窗径路向C57BL/6Cnc小鼠内耳导入正庚醇，所有实验小鼠无感染迹象，无前庭功能受损表现。由于小鼠听泡和耳蜗体积小，又紧邻重要血管和神经，手术操作较为困难。本实验探索到该手术的安全三角区，即由面神经、颈外静脉、胸锁乳突肌三者围成的倒三角，其次磨钻钻孔时动作要轻、稳，不仅要避免伤及周围组织而大量出血，更要避免损伤听小骨、鼓膜、镫骨动脉等重要结构，最后选取微量注射器也较为关键，本实验采用自行改装的微量注射器并通过脑电定位仪可以缓慢、匀速的向听泡内注入药物。下一步本实验将应用该模型进行老年聋相关机制研究。本实验的方法与Lee JH等[17]不同，主要原因为研究目的不同。Lee JH等通过应用噪音的方式制作耳聋模型，进一步研究外周神经元突出传导功能。

老年性耳聋的听力下降一般从高频开始，逐渐发展至中低频，本实验成功注入正庚醇后ABR结果显示对照组小鼠术耳手术前后听力无明显改变，说明手术并没有对小鼠听觉功能产生影响，而实验组小鼠术耳术后ABR平均阈值显著升高，并随时间推移呈逐渐增高的趋势，证实正庚醇能显著影响小鼠听觉功能。分析实验组小鼠各频率ABR平均阈值结果不难看出，本实验小鼠各时间段高频(32 kHz)听力下降较低频(12 kHz)明显，该结果与前人研究结果一致，且与老年性听力下降特点相符[18-19]。

综上所述，本实验成功建立老年性聋的模型，为后续研究老年性聋的发病机制和治疗提供研究基础。另外近年来新兴的内耳基因治疗在耳聋研究中备受关注[20],通过本手术方法也可以向内耳导入基因治疗的药物，为后续的目的基因转入遗传性聋小鼠内耳实验奠定研究基础。