胰岛细胞封装技术的研究进展

杨继建 黄庆先 陈丽

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是一种自身免疫性疾病，患者胰腺中产生胰岛素的β细胞被自身免疫系统逐渐破坏，导致血糖水平升高[1]。据统计，全世界约有4.15亿糖尿病患者，其中T1DM约占10%。T1DM患者必须注射外源性胰岛素以维持正常血糖。然而，这种治疗不能模拟胰岛β细胞的实时胰岛素分泌模式，难以实现葡萄糖代谢的平衡调控[2]，且任何自我管理上的疏忽都可能导致血糖波动，其中低血糖的急性发作风险较高，发作时患者会出现认知障碍、癫痫和昏迷等症状[3-4]。长期和反复的低血糖发作会导致“低血糖无意识综合征”，严重危及患者生命，其病死率占T1DM总病死率的6%～10%[5]，且与T1DM患者平均寿命缩短密切相关。

解决胰岛素注射引起的血糖波动问题成为了研究的重点，现已开发了闭环泵、全胰腺移植和胰岛细胞移植等产品或技术。其中，胰岛细胞移植可通过微创手术替代受损的β细胞，成为治疗T1DM的最佳策略，但由于存在胰岛细胞移植受者需要长期服用免疫抑制剂、供者细胞缺乏、移植后胰岛细胞大量丢失等问题，目前并未在临床实践中广泛使用。为了克服这些问题，研究人员把胰岛细胞包裹在生物材料中，将其与宿主免疫系统隔离并进行保护，该技术被称为胰岛细胞封装技术，可减少胰岛细胞丢失，进而减少或消除排斥反应。另外，胰岛细胞封装技术还可以使用能够产生胰岛素的异源或异种细胞来解决胰岛细胞来源不足的问题。本文围绕胰岛细胞封装技术的发展历程、研究现状及发展方向进行综述。

1 胰岛细胞封装技术的发展历程

1.1 从全胰腺移植到胰岛细胞移植

全胰腺移植是第一个成功重建正常血糖并避免每日注射外源性胰岛素弊端的临床治疗方法。全胰腺移植手术自1966年开始实施，已被证明可在不发生低血糖的情况下，防止糖尿病并发症进展。根据国际胰岛移植注册中心（Collaborative Islet Transplant Registry，CITR）资料显示，随着外科技术、免疫抑制剂治疗和移植术后监测技术的发展，移植胰腺的存活率显著提高，术后1年存活率＞95%，5年存活率＞83%，期间受者无需注射胰岛素[6]。然而，尽管全胰腺移植在临床上取得了一定的成功，但仍存在胰腺供者缺乏、受者需要长期服用免疫抑制剂以及手术并发症（如移植性胰腺炎、腹膜炎、移植性血栓等）风险增加等缺点[7]。目前，全胰腺移植手术仅用于同时接受肾移植手术的T1DM患者。这种不完善的临床治疗方法迫使人们寻找其他替代方案。

全胰腺移植的目的是用外源性胰岛替代非功能性胰岛，重建正常血糖。有趣的是，胰腺中的胰岛数量很少，仅占胰腺总量的2%。而胰岛细胞移植既可避免胰岛素治疗相关并发症，又可降低胰腺切除相关手术风险，因此成为治疗T1DM的最佳选择[8]。2000年，胰岛细胞移植的成功案例被首次报道，7例T1DM患者接受肝门静脉胰岛细胞移植及无糖皮质激素免疫抑制治疗后，平均术后1年内无需注射胰岛素而保持正常血糖[9]。自此胰岛细胞移植研究引起了人们极大的兴趣，世界各地报道了许多成功的胰岛细胞移植案例。移植胰岛细胞的存活率也明显提高，55%～60%胰岛细胞移植受者术后1年内可实现胰岛素独立。在一些选择性研究中，高达92%的胰岛细胞移植受者术后1年内可实现胰岛素独立，44%的受者术后3年内仍然可实现胰岛素独立[10]。根据CITR的报告显示，胰岛细胞移植是治疗T1DM的最佳途径，可确保严格控制血糖代谢，提高受者的生活质量，且无不良反应[7]。

1.2 胰岛细胞移植面临的挑战

胰岛细胞移植虽然取得了很大的进展，但移植胰岛细胞功能无法长期维持成为制约其临床应用的主要障碍。据统计，不到20%的胰岛细胞移植受者5年后仍能维持胰岛素独立[11]，可能与某些非免疫抑制和免疫抑制因素有关。非免疫抑制因素包括胰岛细胞质量差、胰岛细胞数量不足、移植部位的血管化不良、营养供给不足和缺氧导致潜在的移植失败以及炎症反应引起的移植物丢失[12]。免疫抑制因素主要是受者为预防排斥反应而服用免疫抑制剂所致。免疫抑制剂不仅会产生慢性免疫抑制相关不良反应，如肾功能不全、感染易感性增加和肿瘤发生风险增加，也会对胰岛细胞本身产生有害影响，进而导致移植失败。研究发现，西罗莫司（雷帕霉素）、他克莫司等免疫抑制剂均可诱导胰岛β细胞凋亡[13-14]。其他新的免疫抑制方案，如T细胞耗竭（抗CD3单抗）、B细胞耗竭（利妥昔单抗）或诱导外周免疫耐受（抗CD40L单抗和贝拉西普），已经完成了临床前试验或临床试验[15]。然而，目前尚无单一的免疫抑制方案既可防止胰岛细胞移植排斥反应，又不对移植胰岛细胞产生毒性，也不会对移植受者造成严重不良反应。因此，在克服这些缺陷之前，胰岛细胞移植将是一种仅适用于精心挑选的重症T1DM患者的治疗方法。要想在临床上得到广泛的应用，胰岛细胞移植需要一种新的策略。

1.3 胰岛细胞封装技术发展的必然性

胰岛细胞封装技术是一种免疫豁免的策略，这项技术的目的是将胰岛细胞包埋在生物相容性材料中，为胰岛提供一种支撑结构，模拟天然胰岛的微观和宏观环境，使植入的胰岛细胞与机体形成免疫隔离屏障[16]，允许葡萄糖、氧气、营养物质、代谢废物和信号分子的交换，但能阻止免疫细胞或抗体等免疫相关分子的进入[17]。胰岛细胞封装技术的出现引起了极大的关注，该技术不仅解决了胰岛细胞移植过程中细胞来源问题（用于封装的胰岛细胞可以是同种、异种或基因修饰的），还解决了受者需长期服用免疫抑制剂的问题。因此，胰岛细胞封装技术的出现是胰岛细胞移植临床应用的必然选择。

2 胰岛细胞封装技术的研究现状

近20年来，人们一直在探索细胞封装技术，以保护移植细胞免受宿主免疫系统的侵害，但进展缓慢，目前只有少数细胞封装技术进入临床试验阶段，尚未取得临床治疗许可。由于细胞封装技术的复杂性，其组分（高分子材料、包埋细胞、导入外源基因和基因工程DNA载体）所产生的免疫应答未能得到有效豁免。虽然使用高纯度材料可以降低高分子材料引起的免疫应答，但越来越多的研究者认为降低微囊内细胞的免疫原性是防止微囊排斥反应的关键。即使包埋细胞和免疫细胞被包埋材料物理隔离，免疫介质信号也可以双向传递，诱导受者免疫系统对移植微囊的适应性和先天性免疫应答。通过封装材料的改进，精心设计封装细胞以及开发包括干细胞在内的新技术对临床应用具有重要意义。

2.1 封装材料的改进

理想的胰岛细胞封装材料应具备以下特点：（1）完全惰性，不引起受者免疫反应或囊周过度纤维化（pericapsular fibrotic overgrowth，PFO）；（2）坚固不降解，体内存在时间长；（3）与封装细胞相容性高，保持细胞长期存活和功能；（4）表面光滑和亲水性强，减少蛋白质吸附和细胞附着。事实上，PFO和微囊内细胞的炎症反应是决定移植成功与否的主要因素。遗憾的是，目前人们对此仍知之甚少。最近有研究通过改进封装材料减少PFO，如纯化封装材料、改变封装材料的化学成分、免疫调节剂共封装等，为胰岛细胞移植的临床应用开辟了新的方向。

封装材料大多为天然来源，含有蛋白质、多酚和内毒素等免疫原性污染物[18]。研究表明，海藻酸钠中的杂质是导致PFO和移植物存活率低的罪魁祸首[19]。除纯度外，材料的化学成分对生物相容性也有重要影响。高古罗糖醛酸型海藻酸钠制备的微囊比高甘露糖醛酸型海藻酸钠制备的微囊更稳定，免疫保护效果更好[20]。海藻酸钠的黏度和分子量对海藻酸钠微囊的生物相容性也有重要影响。低黏度海藻酸钠制备的微囊可引发强烈的PFO，因此在纯化过程中应去除低分子量组分以增强生物相容性[21]。此外，在材料中加入抗炎剂来对抗PFO也是一种简单易行的方法。在小鼠体内进行异种胰岛细胞移植时，使用混合姜黄素-海藻酸钠微囊可显著减少PFO并改善血糖控制水平[22]。类似研究发现，与未经修饰的微囊相比，含有酮基布洛芬的可降解复合海藻酸钠微囊被移植到CD-1小鼠腹腔时，表现出更好的生物相容性[23]。海藻酸钠微囊与地塞米松共封装时亦表现出更好的生物相容性，并且在移植术后4周从腹腔取出时无PFO[24]。

通过改变封装材料表面的化学结构提高生物相容性和减少PFO也取得了较多进展。用甲氧基聚乙二醇涂覆海藻酸钠-壳聚糖微囊，可形成一个更具生物相容性和免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G排斥性的表面，从而减少PFO[25]。在海藻酸钠微囊上涂覆光交联甲基丙烯酸乙二醇壳聚糖，可在不影响细胞活力和体外功能的情况下，改善微囊的性能，减少PFO，表现出良好的生物相容性[26]。含有聚乙二醇的雷帕霉素包被的海藻酸钠微囊可减少巨噬细胞增殖，并减少PFO。CXC趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）12包被的海藻酸钠微囊可将调节性T细胞聚集到移植部位，长期维持异体和异种移植胰岛细胞的存活和功能[27]。在异种移植中，三唑类化合物修饰的海藻酸钠微囊可减少PFO，且可长期在不使用免疫抑制剂的情况下实现血糖控制[28-29]。

虽然海藻酸钠和其他封装材料的各种改进策略减少了PFO，提高了移植胰岛细胞的存活率，但新的生物相容性材料仍有待开发。新材料应具备不导致PFO，能够在异种或同种异体移植环境中提高移植物存活率，在临床应用中可不使用免疫抑制而实现血糖水平正常化等特点。

2.2 胰岛细胞的封装设计

2.2.1 纳米囊封装 纳米囊封装是通过界面聚合反应将水凝胶交联成纳米保形涂层的同时将单个或聚集的胰岛细胞封装于其内[30]。1997年，Hill等[31]首次将纳米封装的胰岛细胞进行了动物体内研究，探索聚乙二醇纳米囊封装猪胰岛细胞在糖尿病大鼠模型中异种移植的可行性。实验未取得满意的效果，术后短期内大鼠血糖下降到正常水平，但术后60～70 d又恢复了高血糖状态。在灵长类动物实验中，实验结果也不理想，究其原因可能是聚合过程中使用的引发剂对细胞有毒性，降低了胰岛细胞的存活率[32]，以及聚乙二醇涂层不完全封装触发了宿主排斥反应，导致移植失败[33]。克服以上弊端后，研究者进行了一项临床前非人灵长类动物研究，5只糖尿病狒狒腹部皮下组织植入纳米囊封装的异体胰岛细胞，最终3只受体狒狒在术后20个月内实现了胰岛素独立[34]。

尽管纳米囊封装技术取得了重大进展，但从移植物生物安全性的角度来看，纳米囊封装的方法仍然存在局限性，例如，临床上无法控制每个纳米囊的位置，纳米囊封装的胰岛细胞移植术后很难回收等[35]。现有的唯一人体临床试验也以失败告终，受试者未能实现胰岛素独立[36]。因此，必须开发新的方法来实现基于纳米囊封装的更安全的治疗。

2.2.2 微囊封装 微囊封装是将胰岛细胞包埋成直径较小的水凝胶状聚合微球[37]。许多聚合物都可用作微囊封装材料，但理想的微囊封装材料一定要具有良好的生物相容性和温和的成囊条件。目前，海藻酸盐的使用最多，既有单独使用，也有与其他聚合物结合使用[38]。1980年，Lim等[39]首次报道了海藻酸钠微囊封装胰岛细胞的成功案例。但是，单纯的海藻酸钠微囊封装不足以提供胰岛细胞移植所需的机械稳定性。为此，研究者们通过优化材料配方，使用聚阳离子薄层包被等方法提高微囊的机械强度，但一些聚阳离子具有细胞毒性和促炎作用。因此，微囊中常再增加一层海藻酸钠外涂层以隐藏聚阳离子层，典型的由半渗透性聚阳离子层和海藻酸钠外壳构成微囊呈双涂层结构，具有更好的生物相容性，且同时保持了聚阳离子涂层的优点[40]。后来发现，钡离子取代钙离子交联成囊也可以提高微囊的机械强度，且微囊配方中不存在聚阳离子。钡离子交联海藻酸盐微囊对免疫大分子（如IgG）的渗透性更小，更具生物相容性[41-42]。2007年，澳大利亚活细胞技术（Living Cell Technologies，LCT）公司利用海藻酸盐微囊封装猪胰岛细胞进行了一项临床研究，8例T1DM患者接受了不同数量的胰岛细胞移植，其中6例受者在术后长达8个月的时间内表现出外源性胰岛素需求减少，证实胰岛细胞微囊封装治疗T1DM具有安全性和有效性[43]。

微囊封装的优点是直径较小，表面积与体积之比较大，利于氧气和营养物的扩散，对血清葡萄糖水平变化的反应快[44]，且其体积小，可通过微创手术植入，操作简单。尽管微囊封装的优势明显，但其临床应用受到了大规模微囊生产系统的限制。目前可用的细胞微囊封装方法不能在短时间内有效地包埋大量胰岛细胞，引起胰岛细胞缺氧应激，导致功能丧失，存活率下降[44]。而且，治疗性胰岛细胞移植时所需体积较大，增加了移植术后排斥反应的发生风险[45]。最后需要注意的是，与纳米囊封装类似，使用微囊封装胰岛细胞时，移植的胰岛细胞微囊位置无法精确控制，难以完全回收。

2.2.3 巨囊封装 巨囊封装是指包含大量胰岛或胰岛细胞的宏封装系统。应用时，只允许一个或极少数封装有治疗性β细胞的装置移植到体内，且目前已知的巨囊封装系统都是血管外装置，因此，移植部位的氧气扩散和营养物质运输受到限制，导致细胞活力降低和功能丧失[46]。巨囊封装系统主要是由圆形或平面器材组成，胰岛细胞嵌入水凝胶中，并放置在半透膜室中。这种封装系统的设计是为了保护细胞免受机械应力损伤和防止细胞聚集[47]。该设计已在动物实验中被证实可提高移植物存活率，在无免疫抑制的情况下存活时间达6个月[48]。但氧气在半透膜的扩散问题仍限制了其应用，为此，以色列Beta-O2公司开发了一个可以通过外部管道系统提供氧气的装置（β-Air）[49]。猪糖尿病模型研究表明，封装的同种异体胰岛细胞功能得以保留，血糖水平在移植术后数月内降至正常值[50]。

2010年，Carlsson等[51]在临床前研究结果的鼓励下进行了人体试验（NCT02064309），4例患者接受了1～2个β-Air移植，每个装置包含155 000～180 000个胰岛当量（每千克体质量1 800～4 600个胰岛当量），监测3～6个月。结果显示，β-Air植入是安全的，移植胰岛可存活数月，但其在体内发挥的代谢调控功能并不令人满意，试验中仅检测到微量的C肽。封装材料中添加四氟化碳和过氧化钙作为氧源，有可能成为克服氧气限制、确保巨囊封装系统中胰岛细胞的活性和功能的有效策略[52]。

移植物血管化处理是解决低氧供问题的另外一个策略。BioHub封装系统是由美国迈阿密糖尿病研究所开发的一种可注射的胰岛包埋生物材料，该材料由患者自身的血浆和凝血酶制成[40]。这项技术的新颖之处在于封装材料降解后保持胰岛完整，同时允许和促进新生血管的形成，为胰岛提供氧气和营养，维持其生存和功能[53]。一项正在进行的临床试验（NCT02213003）对BioHub宏封装系统进行了评估，初步结果可观，其中1例受者实现了12个月的胰岛素独立及葡萄糖耐量恢复[54]。

巨囊封装的主要优点在于可以将装置中的胰岛细胞精确地植入体内，并且可以在移植失败或发生并发症的情况下取回装置[55]。另外，巨囊封装实现了胰岛细胞的物理分离，防止胰岛细胞聚集，从而提高了细胞的生存能力和存活率[47]。但巨囊封装外部扩散距离较大，氧气供应不足。解决策略包括氧灌注法、生物活性水凝胶包埋法及血管生成因子注入法等[56]。

2.3 干细胞在胰岛细胞封装中的应用

干细胞疗法具有治愈T1DM患者的巨大潜力。随着对各种疾病干细胞疗法研究的不断深入，干细胞治疗T1DM有了许多突破性的进展[57]。首先解决的就是如何获得足够的临床应用级别的胰岛细胞。猪胰岛细胞一直被认为是潜在的来源，其分泌的胰岛素与人源胰岛素仅有一个氨基酸的差别[58]，但异种来源导致的排斥反应阻碍了其临床应用，还需大量基础研究上的突破才有可能应用于临床。干细胞定向分化产生胰岛细胞技术取得了新的突破，特别是人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC）[59]，为获得人源胰岛细胞提供了广阔的前景。干细胞疗法不仅有助于T1MD患者获得来源于人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC）的功能性β细胞[60]，而且有助于获得来源于患者自身的功能性β细胞[61]，这在很大程度上消除了受者对异体移植胰岛细胞的排斥反应。然而，对于自身免疫性疾病导致的T1MD患者来说，自身hiPSC来源的功能性β细胞仍需要封装材料来保护，以避免患者自身免疫系统紊乱产生的破坏。目前，美国ViaCyte公司正在临床试验（NCT04678557）中测试其封装设备PEC-Encap和PEC-Direct的安全性和有效性，这也是目前唯一由干细胞衍生的胰岛细胞替代疗法。其中，PEC-Encap是在免疫隔离装置中封装hiPSC衍生的胰腺祖细胞，允许重要的营养和活性物质在内部细胞与外部血管之间传输；PEC-Direct允许血管进入并直接与植入的细胞相互作用，但受者必须同时进行免疫抑制治疗[62]。

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是近年的研究热点，其分泌的多种细胞因子和生长因子，如白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-8、单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP）-1、基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor，SDF）-1、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β等，可影响人体内的各种反应和信号通路[63]。研究发现，MSC通过向邻近细胞释放可溶性细胞因子和生长因子来抑制免疫反应，导致局部无免疫抑制作用。MSC和胰岛细胞联合移植，可提高移植胰岛细胞的存活率，促进胰岛素分泌和新生血管形成，从而改善移植胰岛细胞的功能[64-66]。

3 小结与展望

综上所述，胰岛细胞移植是治疗T1MD最有前景的方法之一，但受者对封装材料及其内含物的免疫反应是胰岛细胞移植临床应用的主要障碍。哪种胰岛细胞封装技术能更好地实现隔离、保护移植胰岛细胞尚无定论，胰岛细胞的保护和移植位点仍是重点关注问题。深入研究胰岛细胞的封装材料、封装策略和干细胞技术可减少PFO，提高移植成功率，推动胰岛细胞移植快速健康的发展。