不同温度与发酵方式制作的哈密瓜幼果泡菜品质比较

黄 岩，鲜 双，杜 娟，刘兴艳，陈安均*

（1.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014；2.新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所，新疆 吐鲁番 838200）

泡菜是我国传统发酵蔬菜制品之一，具有改善食欲、促进消化等功效，深受人们喜爱。传统泡菜多以新鲜蔬菜为原料，适当添加盐、水和辅料，利用蔬菜表面微生物在厌氧条件下乳酸发酵而制得[1]。水果与蔬菜结构组分接近，也可用于制作泡菜，如泡梨等[2]。哈密瓜是我国极具特色的水果，盛产于新疆吐哈盆地。哈密瓜幼果则是果品生产过程中为防止过度结实，提高果品质量，“疏果”产生的副产物，哈密瓜幼果糖分、有机酸、香气等成分均与成熟果实差距较大，很大程度上限制其加工利用，造成资源浪费。因此，将哈密瓜幼果用于泡菜制作可较好改善这一问题。

发酵温度和方式是决定泡菜品质两大关键因素。温度可通过菌相结构和微生物对营养物质的利用效率影响泡菜品质。汪冬冬等研究温度对甘蓝泡菜发酵过程中风味的影响，发现10～35℃，温度越高，产酸越快，泡菜成熟越早[3]。He等研究酸菜不同温度发酵过程中细菌多样性和挥发性风味物质数量发现，不同温度下酸菜优势菌群不同，且挥发性风味物质随温度升高而增加[4]。不同发酵方式由于优势菌群不同也导致泡菜品质差异较大，自然发酵通常周期长且不稳定，而接菌发酵和卤水发酵可通过增加体系中优势菌数量，加快泡菜成熟和改善泡菜品质。曹佳璐等研究发现，泡菜发酵过程中优势菌群主要为明串珠菌属、乳杆菌属、片球菌属等乳酸菌，且肠膜明串珠菌是泡菜发酵的启动菌，短乳杆菌和植物乳杆菌是发酵后期优势菌群[5]。云琳等对比研究接种发酵、卤水发酵和自然发酵萝卜泡菜理化特性和风味成分，发现卤水发酵泡菜中游离酸及氨基酸含量更高，接种发酵泡菜中香气成分更丰富[6]。

本试验以哈密瓜幼果为原料，以肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、短乳杆菌和戊糖片球菌为接种菌，在12、18和24℃温度下，以自然发酵泡菜为对照，对比混菌发酵泡菜和卤水发酵泡菜。通过测定泡菜理化指标、有机酸含量及挥发性风味成分，结合感官评定，分析温度与发酵方式对泡菜理化指标和感官特征影响，比较不同温度及发酵方式制得泡菜的特点和差异，旨在为哈密瓜幼果泡菜生产工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜哈密瓜幼果购自新疆维吾尔族自治区鄯善县；辅料购自雅安市雨城区苍坪路农贸市场；泡菜卤水采集自雅安市雨城区老面馆自制循环使用的多年老坛。

1.2 菌种

肠膜明串珠菌、短乳杆菌和戊糖片球菌均为四川农业大学食品学院农产品加工与贮藏实验室保藏菌种，分离自泡菜；植物乳杆菌550购自四川高福记生物科技有限公司。

1.3 试剂

氯化钠、氢氧化钠、铬酸钾、硝酸银、亚铁氰化钾、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、乙酸锌均为分析纯，均购自成都科隆化学品有限公司。

1.4 仪器与设备

雷磁PHS-3CpH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；HC-2062高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；电磁炉，杭州九阳生活电器有限公司；全波段酶标仪（3001-2207），美国Thermo公司；气相质谱联用仪（59750），美国Agilent公司；液相色谱仪（Ultimate 3000），美国Agilent公司。

1.5 方法

1.5.1 泡菜发酵工艺

采用自然发酵、混菌发酵和卤水发酵3种发酵工艺，每种工艺分别在12、18、24℃下密封发酵144 h，每隔24 h采样测定相应指标，每种处理均作3组平行。

自然发酵工艺：将大小一致、成熟度相近哈密瓜幼果清洗、去皮去籽、切条整形、晾干水气。各原辅料添加量分别为：800 g哈密瓜幼果，1 600 mL纯净水，80.0 g食盐，16.0 g鲜辣椒，8.0 g生姜，8.0 g大蒜，6.4 g花椒。

混菌发酵工艺：将肠膜明串珠菌、短乳杆菌、戊糖片球菌及植物乳杆菌550分别在MRS培养基中活化3代，8 000 r.min-1离心后得到菌体，生理盐水洗涤3遍，将菌悬液浓度调至108CFU.mL-1，以纯净水体积0.2%等比例加入4种菌液，其他辅料添加同自然发酵。

卤水发酵工艺：每坛添加卤水300 mL和纯净水1 300 mL，其他辅料添加量同自然发酵。

1.5.2 pH测定

取5 mL泡菜液于10 mL离心管中，pH计测定各样品pH。

1.5.3 总酸测定

参考国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》，采用酸碱滴定法测定总酸。具体步骤为：准确称取5 g泡菜匀浆样品，精确至0.001 g，置于100 mL烧杯中。用80 mL无CO2水将烧杯中样品转移至100 mL容量瓶中，置于沸水浴中煮沸30 min（摇动2～3次，使试样中有机酸全部溶解于溶液中），取出，冷却至室温，再用无CO2水定容至100 mL，经快速滤纸过滤，弃去初始滤液后收集备用。量取滤液15 mL，置于250 mL三角瓶中，加入50 mL无CO2水，3滴1%酚酞指示剂，用0.05 mol.L-1氢氧化钠标准滴定溶液滴定至微红色30 s不褪色。记录消耗体积数值，计算总酸含量[7]。

1.5.4 盐度测定

参考赵江欣[8]方法。

1.5.5 亚硝酸盐测定

参考GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》，采用盐酸萘乙二胺法。具体步骤为：准确称取5 g匀浆试样，精确至0.001 g，置于200 mL容量瓶中，加12.5 mL 50 g.L-1饱和硼砂溶液，加入70℃水约100 mL，混匀，于沸水浴中加热15 min，取出置冷水浴中冷却，放置至室温。加入5 mL 106 g.L-1亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5 mL 220 g.L-1乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水定容至刻度，摇匀，放置30 min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去初滤液30 mL，滤液备用。

吸取40.0 mL上述滤液于50 mL带塞比色管中，加入2 mL 4 g.L-1对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3～5 min后加入1 mL 2 g.L-1盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 min，于波长538 nm处测吸光度，同时作空白对照，最后将所测得吸光度通过标准曲线换算得到式样中亚硝酸盐含量[9]。

1.5.6 有机酸测定

参考商景天等方法并略作修改，精确称取5 g匀浆样品，精确至0.001 g，用超纯水转移至50 mL容量瓶中，60℃超声萃取20 min，冷却至室温后，用超纯水定容至刻度，10 000 r.min-1离心10 min，过0.45μm水系滤膜后上机分析。色谱条件：采用C18色谱柱，流动相为0.01 mol.L-1磷酸二氢钾和4%甲醇溶液，流速0.6 mL.min-1，柱温25℃，进样量10μL，紫外检测波长为210 nm[10]。泡菜中常见有机酸包括草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸等，选择上述6种有机酸制作标准曲线，根据标准曲线对泡菜中所测有机酸作定量计算。

1.5.7 挥发性风味物质测定

参考汪冬冬等方法并略作修改[3]。准确称取5 g（精确至0.001 g）捣碎后泡菜匀浆于15 mL顶空进样瓶中，加入1.00 g氯化钠和10μL内标环己酮（26.87 mg.mL-1），置于50.0℃恒温水浴锅中平衡10 min后，将手动进样柄插入进样瓶中，萃取30 min，将萃取头插入气相色谱仪进样口，解析5 min，取出萃取头后分析。

GC-MS操作条件：色谱柱为HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25μm）弹性石英毛细管柱；升温步骤：36℃保持3 min，以5℃.min-1升至65℃，以3℃.min-1升至108℃，以2℃.min-1升至110℃，以3℃.min-1升至155℃，以20℃.min-1升至200℃，保持3 min。不分离进样模式；进样口温度250℃，载气为He，流速1.2 mL.min-1，辅助加热器温度280℃。质谱条件：电子轰击离子源（EI），电子能量70 eV，离子源温度230℃，接口温度280℃，质量扫描范围：50～550 amu。

定性定量分析：由GC-MS得到图谱，经计算机在NIST.11标准谱库检索匹配，筛选出匹配度大于80的挥发性物质，根据内标物环己酮的峰面积和添加量，对筛选出的挥发性物质作半定量分析，得到各组分相对质量浓度。

1.5.8 感官评定

参照陈功方法并略作修改[11]，评分细则见表1。

表1 哈密瓜幼果泡菜感官评价评分细则Table1 Sensory evaluation scorerulesof Hamimelon fruitlet pickles

1.6 数据处理与分析

采用Excel（2016）分析试验数据均值和标准差，采用IBM SPSSStatistics 27分析显著性，显著水平为P＜0.05，使用Origin 2017绘制图表。

2 结果与分析

2.1 泡菜发酵过程中p H和总酸变化

图1a反映不同处理下哈密瓜幼果泡菜发酵过程中pH变化。可发现，除卤水发酵外，自然发酵和混菌发酵泡菜pH受温度影响较大，温度越低，pH下降越缓慢，发酵周期越长，因适宜温度范围内，高温可加快乳酸菌繁殖代谢，加快泡菜发酵过程[12]。通常认为，pH达4.0表示泡菜成熟[13]。卤水泡菜在发酵24 h内，pH出现明显下降，并趋于成熟，这是由于卤水泡菜中存在稳定的微生物群落，微生物可快速利用原料中营养物质生长繁殖。12℃下自然发酵泡菜与混菌发酵泡菜pH下降较为缓慢，此为低温抑制乳酸菌生长代谢所致。

哈密瓜幼果泡菜发酵过程中总酸变化如图1b所示，相同温度下，卤水发酵泡菜总酸明显高于其他泡菜，一方面，由于卤水含有较高含量乳酸等有机酸；另一方面，卤水中原有数量较多的乳酸菌增强体系乳酸发酵能力。除12℃下自然发酵和混菌发酵泡菜外，其他泡菜在发酵96 h后总酸均出现短暂下降，可能是由于发酵中后期泡菜pH不断降低，部分微生物为缓解pH持续下降对自身生长造成的影响，分泌氨基酸脱羧酶形成生物胺以提高pH所致[6]。所有卤水发酵泡菜及24℃下发酵泡菜在发酵144 h后，总酸含量均达到0.4%，由此推测，采用卤水发酵方式及在一定范围内高温发酵泡菜，可明显加快泡菜成熟速度。

图1 泡菜发酵过程中p H和总酸含量变化Fig.1 Changes of p H and titratable acidity contents during thefermentation of pickles

2.2 泡菜发酵过程中盐度和亚硝酸盐变化

泡菜中盐度不仅可调节泡菜口感、抑制腐败菌生长，也可通过渗透压作用影响微生物代谢，间接影响泡菜风味。图2a反映哈密瓜幼果泡菜发酵过程中盐度变化。泡菜发酵前96 h内,盐度逐步上升，发酵120 h后，部分泡菜盐度出现下降，最后趋于稳定，最终盐度为4%～5%，这可能是由于哈密瓜幼果不含盐分，当浸泡在较高浓度盐溶液中时，细胞组织渗透压升高，氯化钠迅速渗入泡菜中造成盐分滞留，而后泡菜与泡菜液盐度逐渐达到动态平衡。12℃卤水泡菜盐度最高，为4.79 g.100g-1，因卤水发酵所添加卤水中含一定浓度盐分，导致卤水发酵泡菜的盐分略高于其他泡菜，而食盐渗透进入泡菜速度随发酵温度降低而减缓，达到渗透平衡较慢，但此后不同温度发酵泡菜的盐度差异小。

哈密瓜幼果泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量变化如图2b所示，18℃混菌发酵、24℃自然发酵及混菌发酵泡菜在发酵48 h后，亚硝酸盐含量达到峰值，这是由于高温加剧硝酸盐还原菌代谢活动而导致“亚硝峰”提前出现。卤水发酵泡菜亚硝酸盐含量相对较低，且波动范围小，维持在较低水平，其中24℃卤水泡菜最终亚硝酸盐含量最低，为7.16 mg.kg-1，因卤水泡菜一直维持在较低pH水平，而高酸性条件不利于亚硝酸盐形成。部分泡菜亚硝酸盐含量较高，但最终结果均低于20.00 mg.kg-1国家限量标准。

2.3 泡菜感官评定

发酵终点各泡菜感官评定值如表2所示，通过显著性分析可知，卤水发酵泡菜在色泽、香气、滋味和接受度方面均明显优于自然发酵和混菌发酵泡菜。总体看，混菌发酵泡菜与自然发酵泡菜间无显著差异，相同发酵方式不同温度所发酵泡菜之间也不存在明显差异，而卤水发酵泡菜与其他两种泡菜感官评分之间存在显著差异。可推测，发酵方式是影响泡菜感官品质主要因素，采用卤水发酵可显著改善哈密瓜幼果泡菜感官品质。采用卤水发酵泡菜可提升泡菜品质，提高生产效率，但不同卤水制得的泡菜难以标准目前尚未实现用于工业化生产。

2.4 泡菜中有机酸变化

采用高效液相色谱法测定9种哈密瓜幼果泡菜发酵终点时有机酸，结果如图3所示。24℃混菌发酵与卤水发酵泡菜中6种有机酸均有检出，其他7种泡菜中未检出酒石酸。泡菜中有机酸总量随温度升高而升高，因温度升高，促进乳酸菌生长繁殖，使其代谢加快，产酸能力增强。

图3 不同哈密瓜幼果泡菜中有机酸含量变化Fig.3 Changes of organic acids contents in different Hamimelon fruitlet pickles

乳酸是哈密瓜幼果泡菜中主要有机酸，其含量随温度升高而逐渐增加。在12、18℃下，不同方式所发酵泡菜中乳酸含量为：卤水发酵＞自然发酵＞混菌发酵，可能因混菌发酵所添加的乳酸菌含量较低，在低温发酵条件下，需较长适应时间和发酵周期，而产酸能力较强的植物乳杆菌、

短乳杆菌和戊糖片球菌主要在发酵中后期发挥作用。由此推断，卤水发酵泡菜中乳酸菌生长繁殖更好，代谢更旺盛，可归因于发酵初期卤水中存在较为稳定的乳酸菌群。24℃下各泡菜中有机酸总量无显著差异，但混菌发酵与卤水发酵泡菜中均检出酒石酸，可能因混菌发酵和卤水发酵泡菜中优势乳酸菌生长更好，发酵过程中产生酒石酸，相关机理有待进一步研究。

酒石酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等味道柔和、刺激性小，可显著改善泡菜风味，比例协调、多种有机酸共同作用可使泡菜风味更加醇和与丰富[14-15]。这可能是卤水发酵泡菜获得高感官评价原因之一。

2.5 泡菜中挥发性风味物质分析

挥发性风味物质是影响泡菜感官品质重要因素，采用顶空固相微萃取技术结合气相色谱质谱联用仪测定9种哈密瓜幼果泡菜发酵终点时挥发性香气成分，如表3所示。共检出43种物质，包括烃类16种，醇类10种、芳香族化合物6种、酮类4种、酯类3种、醛类2种、醚类和脂肪酸各1种。烃类和醇类是主要香气成分，9种哈密瓜幼果泡菜共同香气成分有6种，分别为芳樟醇、2-（5-甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-基）丙-2-基碳酸乙酯、乙酸香叶酯、右旋萜二烯、萜品烯和2,4-二甲基苯乙烯。泡菜风味来源于两方面，一方面是原材料和辅料中的风味物质，另一方面是经微生物作用后新产生的风味物质。泡菜中芳樟醇含量较高，这是由于在泡菜发酵体系中添加较多花椒，而芳樟醇是花椒主要挥发物，阈值为0.037 mg.kg-1，具有花香、木香等特点，右旋萜二烯阈值为0.20 mg.kg-1，具有柑橘香气[16]。以上两种物质是哈密瓜幼果泡菜中含量最高的两种挥发性成分，且具有较低阈值，含量过高，影响泡菜感官品质。

18℃卤水发酵泡菜中共检出22种香气物质，比12℃（20种）和24℃（18种）下卤水发酵泡菜中检出香气物质多，且18℃卤水发酵泡菜香气物质含量相较于12和18℃卤水发酵泡菜更高，在一定程度上与感官评价结果一致，可推测卤水发酵泡菜更适于18℃。对于混菌发酵，18℃时发酵泡菜香气物质同样较多，但相对含量却普遍较低，这可能是由于接种菌在18℃条件下形成更丰富的微生物区系，各微生物间通过拮抗作用所致。自然发酵泡菜随温度升高香气种类增加，但含量无显著差异。

总体上，18℃较12、24℃温度下发酵泡菜中香气物质更多，可能是此发酵温度下保留较多原料本身香味成分同时在微生物发酵作用下也产生较多新的香气成分所致。

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3 讨论与结论

目前，关于哈密瓜副产物研究主要集中在成熟哈密瓜果皮、种子等废料利用方面，而对于其生长过程中因疏果而得到的哈密瓜幼果开发利用却少有研究[17]。将哈密瓜幼果用于泡菜生产，不仅丰富哈密瓜产品种类，解决农副产品利用不充分的问题，还促进果农实现增收致富，具有极大经济价值。

本实验室前期分析采用自然发酵、卤水发酵、植物乳杆菌和/或肠膜明串珠菌5种不同发酵方式发酵的哈密瓜幼果泡菜理化特性和氨基酸含量，发现经发酵的哈密瓜幼果泡菜营养均衡性较好，营养价值较高，证明哈密瓜幼果适用于泡菜制作[18]。但该研究并未探究哈密瓜幼果泡菜挥发性风味物质、有机酸等与泡菜品质相关性质，此外，新疆昼夜温差大，因此探究不同温度下发酵方式的选择对哈密瓜幼果在新疆泡菜发酵具有巨大实际意义。

pH和酸度是泡菜发酵过程中重要基础理化指标，可直观反映泡菜发酵状态，同时也反映泡菜中微生物群落结构变化。卤水泡菜在连续周期发酵过程中可积累大量乳酸菌，发酵体系内环境相对稳定，对干扰因素有较强抵抗能力[19]，因此在发酵过程中pH和亚硝酸盐含量均相对稳定。但采用自然发酵和混菌发酵方式下，“亚硝峰”较明显，在发酵24～120 h期间均有不同程度超过国家限量标准，但随着发酵进行，在发酵终点时亚硝酸盐含量均低于国家限量标准，其作用机理是亚硝酸盐与酸作用，产生游离酸，亚硝酸不稳定，进一步分解产生NO[20]。在几种发酵方式下，发酵96～120 h期间泡菜总酸均有明显下降趋势，可能是由于在发酵前期，微生物大量附着在蔬菜表面，使泡菜总酸迅速升高，当哈密瓜幼果营养物质被大量消耗后，微生物代谢速度降低，哈密瓜幼果泡菜与泡菜水之间酸度值逐渐趋于平衡所致[21]。

挥发性风味物质和有机酸作为泡菜发酵过程中重要代谢产物，影响泡菜风味特征，对泡菜风味有突出贡献，是反映泡菜品质重要指标。乳酸是形成泡菜风味主要有机酸，也是主要发酵产物。在泡菜发酵初期，乳酸菌迅速产酸导致环境pH快速下降，从而抑制不耐酸的杂菌生长繁殖，以保证泡菜产品的安全和品质。发酵温度与有机酸积累有关，在24℃条件下有机酸积累量最多，尽管不同发酵方式下有机酸总量无显著差异，但混菌发酵和卤水发酵条件下，酒石酸积累量明显高于自然发酵。商景天等研究表明，草酸、酒石酸和乳酸等均降解泡菜中亚硝酸盐[10]，这对于泡菜安全性具有积极意义。本研究中，9种哈密瓜幼果泡菜共同香气成分有6种，分别为芳樟醇、2-（5-甲基-5-乙烯基四氢呋喃-2-基）丙-2-基碳酸乙酯、乙酸香叶酯、右旋萜二烯、萜品烯和2,4-二甲基苯乙烯，这6种物质可能是哈密瓜幼果经发酵后的特征性挥发性风味物质，且在18℃卤水发酵的泡菜中检测出的挥发性风味物质最多，与感官评分结果一致，且该条件下发酵的泡菜成熟时间短、亚硝酸盐含量最低（7.16 mg.kg-1）、有机酸含量较高且较为均衡（8.07 g.kg-1）、从营养、感官和安全等方面评价均最佳，因此18℃卤水发酵泡菜是本研究9种泡菜中品质最优泡菜。

以上结果证实温度和发酵方式对泡菜品质均有不同程度影响，其最优发酵方式为卤水发酵，但要用于大批量工业生产还存在一定难度，因卤水性质难以保持固定，产品品质难以实现标准化，这也是将来研究需要攻克的难题[22]。而混菌发酵在工业生产泡菜上已有较多应用，且表现出较好效果，本研究混菌发酵泡菜较自然发酵泡菜而言，品质改善小，这可能与原料本身及发酵规模有关，限制发酵剂作用效果。关于发酵温度，总体上泡菜品质随温度升高而变好，但温度过高也加速泡菜腐败，后续需对泡菜最适发酵温度及作用机理作进一步研究。