L-肉碱对NEFA致肝细胞氧化应激损伤的保护作用

刘志鹏，于志勇，迟 良，胡学远，刘焕奇

（青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109）

奶牛酮病主要是由于机体能量供给和支出出现负平衡（Negative energy balance，NEB），导致糖脂代谢紊乱引发的营养代谢性疾病之一[1-2]。调查研究显示，全球亚临床酮症患病率为24%[3]，我国酮病发病率约为15%～30%，且呈现逐年升高趋势[4]，不仅威胁奶牛健康，也制约奶牛业发展。奶牛通常在产犊后5～6周进入泌乳高峰期，但其采食高峰期和食欲恢复一般在产犊后8～9周，特别是高产奶牛泌乳初期，能量代谢往往处于负平衡，极易造成能量代谢机能障碍[5-6]。此时，泌乳所需能量、脂肪和蛋白质需求增加，而干物质摄入量低于产奶所需能量，为满足产奶需要，奶牛会动员体脂供能。大量体脂动员，使脂肪被水解为甘油和非酯化脂肪酸（Non-esterified fatty acid，NEFA）并释放入血液，转运到其他组织被氧化利用，当血液中NEFA超出细胞需求量时，过剩的NEFA会转运到肝脏进一步代谢。NEFA在肝脏被酯化成丙酮，导致奶牛发生高酮血症，血液中酮体过度累积会引起奶牛食欲不振，进一步加重奶牛NEB状态[7]。同时，肝细胞中过量NEFA无法被及时氧化利用，产生大量氧自由基及活性氧（Reactive oxygen species，ROS），造成肝脏氧化应激损伤，加重酮病病情。

L-肉碱参与脂肪酸氧化及促进脂质代谢氧化。在脂肪代谢过程中，L-肉碱作为载体与酯酰CoA结合成酯酰肉碱，将长链脂肪酸从细胞质转运至线粒体基质，最终释放出酯酰CoA参与β氧化为细胞提供能量[8]。肉碱具有抗氧化特性，可在某些代谢紊乱中保护细胞免受有毒活性氧侵害[9]。肉碱可清除氧自由基，抑制亚油酸脂质过氧化[10]。L-肉碱可提高谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione-peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶活性，减轻因年龄增长而发生的过氧化损伤[11]；补充肉碱可恢复肝细胞肉碱脂酰转移酶-Ⅰ（Carnitine palmityl transferase-Ⅰ，CPT-Ⅰ）酶活性，恢复线粒体膜电位水平，减轻线粒体损伤，减少细胞凋亡[12]。L-肉碱作为一种抗氧化剂，可显著提高机体抗氧化能力，减少氧化损伤，增强机体免疫力和抗病能力，但其可否对NEFA导致的肝脏氧化应激损伤有保护作用鲜有报道。因此，本试验通过建立NEFA诱导小鼠肝细胞AML12氧化应激损伤模型，探讨L-肉碱对NEFA致AML12细胞氧化应激损伤的保护效果，旨在为酮病治疗提供一种新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DME/F12培养基、胎牛血清（FBS）购于美国Hy-Clone公司；油酸、亚油酸、棕搁酸、棕榈油酸、硬脂酸均购自美国Sigma公司；52.6 mmol.L-1NEFA贮存液[配方：油酸1.375 mL（4.35 mmol.L-1）、亚油酸0.152 mL（0.49 mmol.L-1）、棕榈酸0.818 g、棕榈油酸0.151 mL（0.53 mmol.L-1）和硬脂酸0.410 g混于113 mL 0.1 mol.L-1KOH，60℃混匀至全部溶解；再加入7.5 mL预热HCl溶液和67.8 mL双蒸水混匀；用0.22μm滤器滤过除菌后于-20℃保存；20 mmol.L-1L-肉碱贮存液（配方：L-肉碱原粉购于美国Sigma公司，无菌称取80.6 mg L-肉碱粉末加入加入25 mLDME/F12，滤过除菌后于-4℃保存）；丙二醛（MDA）检测盒、过氧化氢酶（CAT）检测盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）检测盒、活性氧（ROS）检测试剂盒均购于南京建成生物工程有限公司；CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、线粒体绿色荧光探针检测试剂盒（Mito-Tracker Green)、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）均购于江苏碧云天生物有限公司；其他化学试剂为均来自国产分析纯。

1.2 细胞株与细胞培养

AML12小鼠正常肝细胞系购置于美国模式培养物集存库（ATCC），STR鉴定正确。细胞复苏后于含10%胎牛血清、1%青链霉素的DME/F12完全培养基，5%CO2，37℃恒温培养箱中培养。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞增殖与细胞毒性检测

生长于对数期AML12细胞消化重悬后，接种于96孔板，每孔加入0.7×105个细胞和200μL完全培养液，置于培养箱中培养至占孔底80%～90%。测定细胞毒性时，每孔分别加入含终浓度为0、0.6、1.2和1.8 mmol.L-1NEFA完全培养液，于37℃孵育24 h；测定细胞增殖时，L-肉碱处理组加入终浓度为1.8 mmol.L-1（跟据预试验筛选最适浓度）L-肉碱与适当浓度NEFA溶液于37℃共孵育24 h。之后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续37℃培养2 h，于450 nm处测定各孔吸光值。每孔设置5个重复，确保试验数据准确性。

1.3.2 氧化应激相关指标测定

MDA含量、T-SOD活性、CAT活性与GSH-Px活性测定：将生长于对数期AML12细胞，消化重悬后按每孔加入5×105个细胞接种于6孔板中，待细胞生长至50%～60%时，加入不同药物处理，分为NEFA组（含终浓度为1.2 mmol.L-1NEFA，细胞毒性试验得出最佳浓度）、L-肉碱组（含终浓度为1.8 mmol.L-1L-肉碱）和L-肉碱干预组（1.8 mmol.L-1L-肉碱+1.2 mmol.L-1NEFA），对照组加同等体积细胞培养液，待细胞生长至80%～90%时收集各组细胞，制备细胞匀浆。于1 000 r.min-1离心10 min，弃置上清收集沉淀。向沉淀中加入1 mL PBS，充分混匀清洗细胞，反复2次。离心完成后，用0.5 mL PBS重悬细胞，于超声细胞破碎仪中，充分破碎细胞。随后根据MDA检测盒及CAT、GSH-Px和T-SOD活性检测试剂盒反应体系和步骤作检测；ROS含量检测：根据ROS检测试剂盒，待6孔板中细胞经L-肉碱和/或NEFA处理后，生长至80%～90%时，每孔加入10μmo.L-1DCFH-DA荧光探针，与培养液混匀再培养60 min。之后消化细胞，重悬并用PBS洗涤2次，于1 000 r.min-1离心5 min，收集细胞沉淀并用1×PBS重悬细胞，加入新的6孔板中，避光转移至荧光显微镜下，观察细胞荧光。

1.3.3 线粒体分布检测

6孔板中细胞经L-肉碱和/或NEFA处理后，取对数期AML-12细胞，吸除6孔板中全部培养液，改换为预先37℃温浴的Mito-Tracker Green工作液，轻缓摇动使之分散均匀，置于37℃培养箱中孵育30 min。孵育完成后换为每孔2 mL完全培养液，避光移至荧光显微镜下观察。激发光波长为490 nm，发射波长为516 nm。

1.3.4 线粒体膜电位测定

根据线粒体膜电位检测试剂盒，6孔板中细胞生长至80%～90%时，使用PBS洗涤1次。然后每孔加1 mL培养液与1 mL JC-1工作液，充分混匀后置于37℃培养箱孵育20 min。孵育结束后，吸除所有培养液，每孔加入2 mL预冷的JC-1染色缓冲液，轻摇洗涤细胞2次，每次3 min。清洗完成后去除JC-1染色缓冲液，每孔加入2 mL完全培养液，避光转移至荧光显微镜下，30 min内完成观察。检测JC-1单体时，激发波长设置为490 nm，发射波长设置为530 nm；检测JC-1聚合物时，激发波长设置为525 nm，发射波长设置为590 nm。

1.4 数据处理

使用GraphPad Prism7.04软件作差异性分析和作图，使用Image J软件对细胞荧光图片作定量分析，统计方法采用单因素方差分析，配合Tukey事后检验。当分析结果P＜0.05时，表明试验结果差异极显著。

2 结果与分析

2.1 L-肉碱对NEFA致AML12细胞毒性的影响

细胞毒性检测结果（见图1）显示，AML12细胞存活率随NEFA浓度增加而降低，NEFA浓度在1.2 mmol.L-1（P＜0.01）、1.8 mmol.L-1（P＜0.01）时与对照组（0 mmol.L-1）相比均极显著下降，表明高浓度NEFA具有明显细胞毒性。因此，后续试验选取1.2 mmo.L-1NEFA作为体外刺激浓度进行试验。细胞增殖检测结果发现L-肉碱单独处理对细胞活性无显著影响，而当L-肉碱与NEFA共孵育时，细胞存活率较仅加入1.2 mmol.L-1NEFA组极显著上升（P＜0.01），表明L-肉碱对NEFA造成的细胞毒性具有保护效果。

图1 L-肉碱对NEFA致细胞毒性的影响Fig.1 Effect of L-carnitineon NEFA induced cytotoxicity

2.2 L-肉碱对NEFA致AML12细胞氧化应激的影响

氧化应激相关指标检测结果显示，与对照组相比，NEFA处理后，细胞MDA含量极显著升高（见图2A，P＜0.01），T-SOD活性极显著降低（见图2B，P＜0.01），表明NEFA引起细胞氧化应激损伤。检测结果还发现，L-肉碱对细胞MDA，TSOD水平无显著影响，而在NEFA中加入L-肉碱共孵育组中，细胞MDA含量较单独NEFA处理组极显著降低（P＜0.01），T-SOD活性则呈现与MDA相反趋势（P＜0.01），表明L-肉碱对NEFA诱导的细胞氧化应激损伤有保护效果。

图2 L-肉碱对NEFA诱导AML12细胞MDA和T-SOD变化的影响Fig.2 Effect of L-carnitine on NEFA-induced MDA level and T-SOD vitality in AML 12 cells

抗氧化酶CAT和GSH-Px活性检测结果显示，与对照组相比，NEFA极显著降低肝细胞CAT（见图3A，P＜0.01）和GSH-Px（见图3B，P＜0.01）活性，进一步表明NEFA引起细胞氧化应激损伤。L-肉碱对细胞CAT和GSH-Px水平无显著影响，而在NEFA中加入L-肉碱共孵育组中，细胞CAT（P＜0.01）和GSH-Px（P＜0.01）活性极显著增加，表明L-肉碱对NEFA诱导的细胞氧化应激损伤有保护效果。

图3 L-肉碱对NEFA诱导AML12细胞CAT和GSH-Px变化的影响Fig.3 Effect of L-carnitine on NEFA-induced CAT level and GSH-Px vitality in AML 12 cells

为进一步证实L-肉碱对NEFA诱导AML12细胞氧化应激损伤的保护作用，本试验检测ROS含量。

如图4所示，与对照组（见图4A）相比，NEFA组（见图4B）细胞荧光强度显著增加，而L-肉碱组（见图4C）细胞荧光强度不变；L-肉碱+NEFA共孵育组（见图4D）荧光强度较NEFA单独处理组荧光强度明显降低。相对定量分析发现，L-肉碱+NEFA（见图5）共孵育组极显著降低NEFA引起ROS上调（P＜0.01），提示NEFA通过诱导ROS产生，导致细胞产生氧化应激损伤；添加L-肉碱可减少NEFA诱导的ROS增加。

图4 L-肉碱对NEFA诱导AML12细胞ROS变化的影响Fig.4 Effect of L-carnitineon NEFA-induced ROSlevels in AML 12 cells

图5 定量分析L-肉碱对NEFA诱导AML12细胞ROS变化的影响Fig.5 Quantitative analysis the effect of L-carnitineon NEFA-induced ROSlevelsin AML12 cells

2.3 L-肉碱对NEFA诱导AML12细胞线粒体分布变化的影响

在证实NEFA诱导AML-12细胞氧化应激损伤基础上，本试验继续探索L-肉碱对NEFA导致AML-12细胞线粒体损伤程度的影响。如图6所示，对照组（见图6A）中细胞绿色荧光均匀分布在胞质中，NEFA组（见图6B）中集中分布于细胞膜周边，且荧光面积和强度显著降低，细胞中出现黑色空洞，表明线粒体在受到NEFA刺激后，发生线粒体聚集，甚至有些线粒体失去活性。而在L-肉碱处理组（见图6C），线粒体荧光分布与对照组相似，L-肉碱+NEFA共孵育组（见图6D）荧光强度比单独NEFA处理组荧光强度明显升高。量化分析结果显示，L-肉碱+NEFA共孵育组（见图7）对比NEFA组，线粒体异常分布率显著降低（P＜0.01），表明L-肉碱对NEFA造成的线粒体分布异常有保护作用。

图6 L-肉碱对NEFA诱导AML12细胞线粒体分布变化的影响Fig.6 Effect of L-carnitine on NEFA-induced Mitochondrial distribution in AML 12 cells

图7 定量分析L-肉碱对NEFA诱导AML12细胞线粒体分布的影响Fig.7 Quantitative analysis the effect of L-carnitine on NEFA-induced Mitochondrial distribution in AML 12 cells

2.4 L-肉碱对NEFA诱导AML12细胞线粒体膜电位变化的影响

NEFA诱导ROS产生，ROS主要产生部位为细胞线粒体，ROS大量升高引起线粒体膜电位异常，诱导细胞死亡。因此本试验检测L-肉碱对NEFA导致AML-12细胞线粒体膜电位变化。由图8可知，NEFA组（见图8B）高线粒体膜电位红色荧光较对照组（见图8A）和L-肉碱处理组（见图8C）减少，而低线粒体膜电位绿色荧光增加，表示NEFA可降低线粒体膜电位。但与NEFA组相比，经L-肉碱处理后（见图8D）细胞红色荧光明显增强，绿色荧光明显减弱，表明L-肉碱可以改善NEFA介导的线粒体膜电位降低。相对定量分析发现（见图9），NEFA组红/绿平均荧光强度比率与对照组（P＜0.01）和L-肉碱处理组（P＜0.01）相比均极显著降低，表明NEFA可降低细胞线粒体膜电位。而添加L-肉碱后，与NEFA单独处理组相比，红/绿平均荧光强度比率显著升高（P＜0.05），表明添加L-肉碱可改善NEFA对线粒体膜电位的抑制作用。

图8 L-肉碱对NEFA诱导AML12细胞线粒体膜电位变化的影响Fig.8 Effect of L-carnitineon NEFA-induced mitochondrial membranepotential changes in AML 12 cells

图9 定量分析L-肉碱对NEFA诱导AML12细胞线粒体膜电位变化的影响Fig.9 Quantitative analysisthe effect of L-carnitine on NEFA-induced mitochondrial membrane potential changes in AML12 cells

3 讨论

奶牛酮病主要特征性之一为NEFA显著升高，其已被作为预测酮病发生有效指标[13]。研究显示，酮病奶牛体内NEFA与SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性呈负相关，与MDA、H2O2等氧化应激指标变化呈正相关。同时NEFA也被证实可引起奶牛肝细胞氧化应激反应[14]。因此，本试验建立起小鼠肝细胞（AML12）NEFA暴露模型，研究L-肉碱对NEFA致细胞氧化应激损伤作用。

本试验中，NEFA在1.2 mmol.L-1时可显著降低小鼠肝细胞AML12细胞活性，说明此浓度可引起显著细胞毒性。王兴慧等研究证实NEFA可通过抑制PGC-1α表达，引起肝脏脂代谢酶基因表达紊乱，导致肝细胞脂蓄积[15]。董记红等研究中，1.2 mmol.L-1NEFA造成犊牛肝细胞SOD活性显著降低，MDA水平显著上升[16]。Li等研究表明1.2和2.4 mmol.L-1NEFA组LDH释放显著增加，GSH-Px含量显著降低，细胞内ROS水平显著升高[17]。因此，本试验结合细胞毒性试验，最终选取1.2 mmol.L-1浓度进行后续试验。NEFA浓度选择不同可能与细胞种属差异有关，但从小鼠和牛肝细胞中均发现NEFA可引起细胞氧化应激损伤。

肉碱为一种广泛存在于生物体内的类维生素氨基酸衍生物，其在调节脂肪酸代谢、氧化还原反应、炎症信号传导等众多生理功能中起重要作用[18]。研究表明，L-肉碱预处理可显著提高氧化应激细胞模型T-AOC，抗氧化剂水平（T-GSH、GSH），同时提高抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活力[19]。L-肉碱在氧化应激恢复中起重要作用[20]。本试验结果发现NEFA可上调小鼠肝细胞AML-12 MDA水平，降低抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性，而添加L-肉碱可提高SOD、CAT、GSH-Px活性以及减少MDA含量，与上述研究结果基本相似。SOD活力能一定程度反映细胞氧化应激状态和清除活性氧的能力，常与MDA检测相互参照，利用MDA含量验证细胞受活性氧侵害损伤程度，二者联合鉴定细胞氧化应激状态。添加L-肉碱后，SOD活力相对于NEFA单独处理组有明显提高，可能是L-肉碱利用其氧化还原特性直接消耗掉部分O-，亦补充L-肉碱直接或间接激活其他抗氧化酶活化途径，但仍需进一步验证。

线粒体为ROS主要产生部位。酮症奶牛NEB状态导致肝细胞中NEFA处于高代谢状态，其在线粒体氧化过程中会产生大量ROS，导致氧化应激损伤，诱导细胞凋亡[21-22]。研究表明，在奶牛肝细胞中，ROS水平和凋亡率以NEFA剂量依赖性方式增加。高浓度NEFA可产生过量ROS，导致单核细胞氧化应激，说明NEFA可通过线粒体释放大量ROS，进而破坏氧化/抗氧化平衡，造成细胞氧化应激损伤。本研究发现NEFA诱导大量ROS产生，而添加L-肉碱后，细胞中ROS荧光强度明显降低。ROS定量分析结果也显示相似结果，说明L-肉碱可显著降低NEFA诱导的细胞氧化应激水平。结合MDA含量与SOD、CAT、GSH-Px活力变化，推断出L-肉碱对NEFA诱导的细胞氧化应激损伤有一定保护作用。

线粒体内稳态对细胞正常功能至关重要[23]。氧化应激引起线粒体功能紊乱，线粒体功能障碍包括线粒体膜电位改变，线粒体数量减少以及由于细胞和组织中ROS积累而导致其氧化蛋白活性改变[24]。NEFA诱导产生的ROS可损伤线粒体功能，进一步对细胞造成损伤，最终导致肝功能异常。利用荧光探针Mito-Tracker Green标记线粒体细胞内分布，结果显示NEFA处理降低肝细胞细胞绿色荧光面积和强度，表明线粒体在受到NEFA刺激后，肝细胞线粒体发生聚集，甚至有些线粒体失去活性，而添加L-肉碱共孵育后细胞荧光强度较单独NEFA处理组明显升高，表明L-肉碱对NEFA造成的线粒体分布异常有一定程度保护作用。对线粒体膜电位检测也有类似结果，NEFA处理肝细胞后，线粒体膜电位明显降低，而添加抗氧化剂L-肉碱可稳定NEFA导致的线粒体膜电位下降。结合ROS变化和线粒体分布结果，更加确证L-肉碱对NEFA诱导的肝细胞氧化应激损伤具有保护作用，可以考虑将其作为饲料添加剂应用于奶牛酮病的预防及辅助治疗。但本试验未使用奶牛肝细胞进行验证因此存在一定局限性，后续仍需在牛肝细胞和酮病奶牛中开展相关研究。

4 结论

本试验从体外证实NEFA可诱导小鼠肝细胞线粒体损伤，引起细胞ROS释放，造成细胞SOD、CAT、GSH-Px活性下降，MDA水平显著升高，最终导致小鼠肝细胞氧化应激损伤；L-肉碱可通过稳定线粒体膜电位、改善线粒体异常分布，从而减少细胞ROS释放、提高SOD、CAT、GSH-Px活性和减少MDA含量，保护NEFA致小鼠肝细胞氧化应激损伤。