野生大豆GsSnRK1.1蛋白激酶在淹水胁迫下功能分析

丁晓东，张 晴，于海燕，刘圆明，李明龙，肖佳雷

（1.东北农业大学农业生物功能基因重点实验室，哈尔滨 150030；2.望奎县种子能源服务中心，黑龙江 望奎 152100）

大豆（Glycinemax）蛋白含量和出油率高，种植面积广泛，是我国重要粮食作物之一[1-2]。其中栽培大豆对淹水胁迫较为敏感，当发生涝害时，其根系淹水沤根，叶片黄化，大豆光合速率、株高、荚果数和种子产量降低[3-4]。野生大豆是栽培大豆亲缘种，在形态上具有发达根系和柔性藤蔓状枝干，在基因水平上具有遗传多样性，对环境适应性强，对涝害具有较强耐受性[5]。研究野生大豆淹水胁迫分子调控机制，可为大豆抗涝品种育种提供理论基础。同时，来自野生大豆的优良基因可直接应用于栽培大豆育种，解决栽培大豆对淹水胁迫较为敏感的问题，对实现栽培大豆品种改良具有重要意义。

植物蔗糖非发酵-1-相关蛋白激酶-1在参与生长发育、基础代谢、胁迫应答以及碳氨代谢等多项生理活动中发挥重要作用[6-8]。Lovas等最早发现植物SnRK1蛋白激酶在马铃薯高盐胁迫下敏感性，发现马铃薯反义StubGAL83基因在高盐胁迫下根细胞较小比野生型更为敏感；SnRK1蛋白激酶可通过改变淀粉合成，将其回流到植物根中，从而影响地上部分植物口感，减少食草性动物食用[9]。番茄叶片中SISNF基因在干旱胁迫下表达量升高，猜想番茄SISNF基因参与干旱胁迫调控[10]。Kudahettige等发现在淹水处理下，拟南芥中过量表达水稻SnRK1基因，促进植物体内淀粉降解，提升对植物细胞能量供给和植物存活能力[11]。但SnRK1如何响应淹水胁迫，增强植物抗逆性的分子机制尚不明确。

由于栽培大豆是重要粮食作物，其野生近缘种野生大豆对环境适应环境能力强，喜水耐湿，多生于山野以及河流沿岸、湿草地、湖边、沼泽等地，因此野生大豆是研究耐淹水基因重要植物材料。为研究GsSnRK1.1蛋白激酶在淹水胁迫中作用与功能，在野生大豆（Glycinesoja）中克隆GsSnRK1.1基因、启动子及点突变基因；在Col-0野生型拟南芥中超表达以35S启动子驱动的GsSnRK1.1、GsSnRK1.1（T176A）、GsSnRK1.1（T176E）和GsSnRK1.1（K49M）基因，获得转基因植株；通过对野生大豆不同时间淹水处理，利用RT-qPCR分析GsSnRK1.1基因在淹水胁迫条件下时空表达模式，同时也对pGsSnRK1.1::GUS转基因拟南芥植株作GUS染色，从侧面印证qRT-PCR数据正确性；将GsSnRK1.1基因在拟南芥中过量表达，测定其叶绿素、SOD和Pro等生理指标，以及ADH1（EC1.1.1.1）、PDC1（EC4.1.1.1）标记淹水应激反应基因在Col-0与转基因拟南芥中基因表达。试验对GsSnRK1.1基因功能验证分析，为探究大豆抗涝品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

野生大豆为Glycine soja（G07256），拟南芥为Columbia-0，以pCAMBIA3301和pCAMBIA2300为植物表达载体。研究所用菌株为农杆菌GV3101和大肠杆菌DH5α。以上材料均由东北农业大学植物与环境互作实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 总RNA、总DNA提取及cDNA合成

将饱满且无病虫害野生大豆（G07256）种子用浓硫酸处理6～10 min去除种皮表面泥膜，倒掉浓硫酸，自来水冲洗5次。冲洗后种子放在含湿润滤纸培养皿上，为其提供萌发所需水分，25℃黑暗培养，培养时间为2～3 d。当种子发芽达到2 cm时，转移至人工气候室水培，设置温度为25℃，营养液每隔2～3 d更换一次。待幼苗生长至六叶期时，使用相应试剂盒提取总RNA/DNA以及反转录合成cDNA。

1.2.2 基因克隆

根据NCBI基因数据库所提供GsSnRK1.1（KHN13196）基因及其启动子CDS全长序列信息，使用Primer Premier 5.0设计引物。克隆所用模板为野生大豆cDNA和DNA，作基因及启动子序列扩增。进一步根据位点设计引物，引物序列如表1所示。通过引物重叠PCR方法获得激酶调控区域失活的转录本GsSnRK1.1（T176A）、激酶调控区域模拟磷酸化的转录本GsSnRK1.1（T176E）和催化区域失活的转录本GsSnRK1.1（K49M）基因片段。其中将GsSnRK1.1第176位苏氨酸（Thr，T）密码子替换为谷氨酸（Glu，E）与丙氨酸（Ala，A）密码子，第49位赖氨酸（Lys，K）密码子突变为甲硫氨酸（Met，M）密码子。KpnⅠ-XbaⅠ内切酶酶切pCAMBIA2300质粒使之线性化，再利用T4DNA连接酶构建超表达载体，获得p2300-35S-Myc-GsSnRK1.1、p2300-35S-Myc-GsSnRK1.1（T176A）、p2300-35S-Myc-GsSnRK1.1（T176E）、p2300-35SMyc-GsSnRK1.1（K45M）超表达载体；Eco RⅠ-NcoⅠ内切酶酶切pCAMBIA3301质粒使之线性化，利用T4DNA连接酶将GsSnRK1.1基因内源启动子替换载体原本35S启动子获得p3301-GsSnRK1.1P-GUS启动子报告表达载体；BglⅡ-BstEⅡ内切酶酶切p3301-GsSnRK1.1P-GUS，再利用同源重组试剂盒构建载体，获得p3301-GsSnRK1.1P-Myc-GsSnRK1.1

1.2.3 转基因植株获得

利用冻融法将构建成功的过表达载体和启动子驱动GUS基因重组质粒转入农杆菌，而后农杆菌侵染模式植物拟南芥，使用方法为蘸花法[12]。种植完成侵染的拟南芥种子，长出两片子叶时开始喷洒抗生素筛选转基因植株，其中利用卡纳霉素和除草剂（Basta）分别喷洒pCAMBIA2300和pCAMBIA3301载体侵染的拟南芥。筛选过后对其作PCR和Western blot鉴定，确定是否为转基因纯合体株系。

1.2.4 表型分析及生理指标测定

为模拟长时间淹水情况，将拟南芥野生型和缺失突变体种子置于灭菌EP管中，加入1 mL 30%NaClO，消毒15 min，用灭菌ddH2O清洗种子6～8次，最后向EP管中加入适量灭菌ddH2O，4℃春化处理48 h。用灭菌牙签将种子点在含0.8%琼脂和1%蔗糖的1/2MS固体培养基试管中，将试管置于人工气候箱中培养。待植物生长至四叶期时，将10 mL经高压灭菌过蒸馏水小心灌入每个试管中，黑暗中放置37 d，观察其表型并测定生理指标。

1.2.5 淹水应激反应标记基因表达分析

对淹水胁迫处理37 d拟南芥幼苗提取总RNA，利用RT-qPCR测量乙醇脱氢酶1（ADH1；At1g77120）和丙酮酸脱羧酶1（PDC1；At4g33070）标记基因对淹水胁迫的响应。

1.2.6 野生大豆GsSnRK1.1表达特性分析

将三周龄野生大豆幼苗完全浸没至水中处理2 d，分别在0、6、12、24及48 h不同时间点取样；选用Plant RNA Kit（OMEGA）提取总RNA，使用ReverTra Ace qPCRRTMaster MIX with gDNA Remover cDNA试剂盒（TOYOBO）反转录合成cDNA，使用SYBRGreen试剂盒（TOYOBO）对GsSnRK1.1基因作实时荧光定量PCR，结果分析采用比较CT法（ΔΔCT法）。

2 结果与分析

2.1 野生大豆GsSnRK1.1基因克隆与序列分析

PCR扩增结果见图1，获得GsSnRK1.1基因、启动子及点突变基因，其中基因长度为1 548 bp，启动子长度为1 663 bp，因此选择DL2000 DNA Marker。经克隆、测序确定GsSnRK1.1为所需研究基因。

图1 野生大豆GsSnRK1.1基因克隆及点突变测序Fig.1 GsSnRK1.1 gene cloning and point mutation sequencing

2.2 野生大豆GsSnRK1.1基因表达响应淹水胁迫

SnRK1是一种广泛存在于植物体内的Ser/Thr蛋白激酶，其蛋白活性对植物体生长发育、新陈代谢及非生物胁迫抗逆具有重要作用。为探究野生大豆GsSnRK1.1基因对淹水胁迫的响应，分别对野生大豆淹水处理0、6、12、24和48 h，并对不同淹水时间处理野生大豆内源GsSnRK1.1基因作转录水平分析。结果如图2所示，随淹水处理时间增加，野生大豆中GsSnRK1.1基因转录水平随之显著升高。为进一步探究野生大豆GsSnRK1.1基因启动子对淹水胁迫的响应，构建pGsSnRK1.1::GUS稳定表达株系，GUS染色结果如图3所示，可观察到与未淹水处理对照组相比，淹水处理后染色效果更为明显，说明GsSnRK1.1基因启动子感知淹水胁迫进而促进基因转录。

图2 GsSnRK1.1在淹水胁迫下表达模式Fig.2 Expression pattern of GsSnRK1.1 gene under waterlogging stress

图3 淹水胁迫下proGsSnRK1.1:GUS转基因幼苗GUS染色Fig.3 GUSstaining of proGsSnRK1.1::GUS transgenic seedlings under waterlogging stress

2.3 GsSnRK1.1及其点突变在拟南芥中超表达鉴定

为研究GsSnRK1.1蛋白激酶在植物抵抗淹水胁迫中功能，将GsSnRK1.1及其3个活性位点突变基因在Col-0拟南芥中超表达。以atkin10为阴性对照，利用相应抗性筛选后获得T1代，再利用T5 Direct PCR（plant）试剂盒对初步筛选得到的转基因植株作基因型鉴定，如图4所示，Col-0超表达植株对GsSnRK1.1及其3个位点突变基因作PCR鉴定，基因长度为1 548 bp。

图4 GsSnRK1.1及其3个点突变基因超表达植株PCR鉴定Fig.4 PCR identification of overexpressed plantswith GsSnRK1.1 and three point mutated genes

从鉴定正确的T1代单个植株上收集种子，进一步对T2代作抗性和基因型筛选，获得纯合T3植株。为进一步确认转基因超表达和回补T3代拟南芥中蛋白表达，提取拟南芥叶片蛋白，并作Western blot蛋白水平测定，结果如图5所示，通过anti-Myc抗体验证确定35S启动子驱动的Myc-GsSnRK1.1、Myc-GsSnRK1.1（T176E）、Myc-GsSnRK1.1（T176A）、Myc-GsSnRK1.1（K49M）和空载体转化的纯合T3代中靶蛋白表达水平。

图5 转基因拟南芥Western blot蛋白水平检测Fig.5 Western blot protein level detection of transgenic Arabidopsis thaliana

2.4 GsSnRK1.1在淹水胁迫下生理指标测定

为进一步确定GsSnRK1.1蛋白激酶在淹水胁迫中生理功能，本研究利用超表达GsSnRK1.1、GsSnRK1.1（T176A）、GsSnRK1.1（T176E）和GsSnRK1.1（K49M）研究拟南芥转基因植株。如图6所示，Col-0绿化程度略高于atkin10，但并不明显；表达GsSnRK1.1蛋白激酶和模拟磷酸化GsSnRK1.1蛋白激酶（OE#T176E）的拟南芥叶片明显呈绿色，且比Col-0绿化程度更高；而表达催化区域失活的GsSnRK1.1蛋白激酶（OE#K49M）和表达调控区域失活的GsSnRK1.1蛋白激酶（OE#T176A）的拟南芥在淹水条件下明显叶片失绿，且比atkin10绿化程度更低；进一步测定各株系叶绿素含量，如图7所示，叶绿素含量与表型相符，说明GsSnRK1.1蛋白激酶活性可降低拟南芥在淹水条件下叶片失绿。

图6 淹水胁迫下转基因株系表型Fig.6 Phenotypesof transgenic linesunder waterlogging stress

图7 淹水胁迫下转基因拟南芥叶绿素含量Fig.7 Chlorophyll content of transgenic Arabidopsis thaliana under waterlogging stress

测定经淹水胁迫处理后转基因拟南芥体内超氧化物歧化酶（SOD）和脯氨酸（Pro）含量，并计算淹水处理前后SOD和Pro含量增加倍数。如图8A所示，经淹水胁迫后，Col-0体内SOD酶活增加约20倍，OE#GsSnRK1.1和OE#T176E体内SOD酶活增加倍数约为35倍，且显著高于Col-0；OE#T176A体内SOD酶活增加约10倍，OE#K49M体内SOD酶活增加约7倍，atkin10体内SOD酶活增加约6倍，均显著低于Col-0。如图8B所示，淹水处理后，Col-0体内Pro含量增加约50倍，OE#GsSnRK1.1和OE#T176E体内Pro含量增加倍数分别约为140倍和170倍，且显著高于Col-0株系；OE#T176A体内Pro含量增加约23倍，OE#K49M体内Pro含量增加约24倍，atkin10株系中Pro含量增加约20倍，且三者均显著低于Col-0株系。由此说明，GsSnRK1.1可提高拟南芥SOD活性和Pro含量以抵抗淹水胁迫。

图8 淹水胁迫下转基因株系中SOD和Pro含量增加倍数Fig.8 Fold increase of SOD and Pro contents of transgenic lines under waterlogging stress

2.5 GsSnRK1.1影响淹水应激反应标记基因表达

乙醇脱氢酶1（ADH1）和丙酮酸脱羧酶1（PDC1）是标记淹水应激反应基因，为检测SnRK1活性对氧缺乏期间基因调节的影响，测定ADH1和PDC1标记基因在淹水胁迫下表达。如图9所示，ADH1和PDC1在Col中上调，并在表达OE#GsSnRK1.1（野生型GsSnRK1.1）和OE#GsSnRK（T176E）（表达模拟磷酸化GsSnRK1.1）转基因植物中进一步上调，但在OE#GsSnRK1.1（T176A）和OE#GsSnRK1.1（K49M）（表达无激酶活性的GsSnRK1.1）转基因植物中几乎未发生ADH1和PDC1基因上调。结果表明，GsSnRK1.1诱导淹水应激反应的两个标记基因表达，其依赖于GsSnRK1.1蛋白激酶活性。

图9 淹水应激反应标记基因表达模式Fig.9 Expression pattern of marker genes for stress responseto flooding

3 讨论

植物中蔗糖非发酵-1-相关蛋白激酶-1（SnRK1）与酵母SNF1和哺乳动物（AMPK）同源[11]。其中SnRK1蛋白激酶在感应新陈代谢方面具有重要意义，可抵抗各种压力并保持能量稳态[12]。SnRK1在植物抵抗生物及非生物胁迫过程中发挥作用，添加葡萄糖和ABA处理时，超表达SnRK1植株对ABA敏感程度更强。PP2C被ABA降低进一步提高SnRK1活性，通过两个互补过程相互作用增强应激反应，并为ABA和糖信号通路之间广泛遗传相互作用提供解释[14-15]。SnRK1α植物防御机制在食草动物、真菌、细菌和病毒中扮演重要角色[16-17]。首次发现植物SnRK1参与胁迫响应是反义表达StubGAL83的马铃薯对高盐胁迫极其敏感[18]。AtKIN10（SnRK1.1）在拟南芥耐淹性和抗盐信号途径调节过程中存在拮抗作用[19]。拟南芥（Arabidopsis thaliana）SnRK1活性提升拟南芥耐淹水能力，参加控制胁迫耐受的信号途径存在特异性，超表达失去激酶活性的OsSnRK1或者AtKIN10突变转录本植株，在淹水处理下其叶片明显白化[20]。本研究发现GsSnRK1.1可提高转基因拟南芥对淹水胁迫抗性，且在抵抗淹水胁迫中GsSnRK1.1蛋白激酶酶活性发挥关键作用。

植物受淹水胁迫后降低光合速率，进而影响其生长发育及产量收益，因此挖掘和利用抗逆基因资源对提高作物抗逆性非常重要。本研究选用野生大豆为植物材料，从中克隆GsSnRK1.1基因，通过多序列比对发现其蛋白结构中保守的STKc-AMPK-alpha结构域，以及对于行使蛋白激酶功能十分重要的保守氨基酸位点：K49和T176。其中第176位苏氨酸（Thr，T）是受上游激酶调控的特异性磷酸化位点，当其被上游激酶磷酸化，则激活催化区域第49位赖氨酸（Lys，K）从而磷酸化下游底物蛋白，影响植物生长发育。在Col-0野生型拟南芥中超表达以35S启动子驱动GsSnRK1.1、GsSnRK1.1（T176A）、GsSnRK1.1（T176E）和GsSnRK1.1（K49M）基因，获得转基因植株，检测GsSnRK1.1蛋白激酶活性对淹水胁迫标记基因调节的影响，并测定ADH1和PDC1标记基因在淹水胁迫下基因表达，结果表明，野生大豆GsSnRK1.1诱导淹水应激反应的两个标记基因表达，GsSnRK1.1基因对淹水胁迫响应，且参与淹水应激反应调控。有关GsSnRK1.1蛋白激酶对淹水胁迫下大豆根系乙醇脱氢酶、活性氧代谢系统及碳氮代谢等影响仍需进一步研究。