异甘草素抗腹泻活性及其分子机制研究

邢晓旭，张宗山，赵莹莹，张馨慧，曾丹丹，赵玉珠，张 旭

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

腹泻是临床常见疾病，严重危害公共卫生安全并造成严重经济损失，也是制约畜牧业发展因素[1]，引起腹泻原因包括细菌性腹泻、病毒性腹泻、寄生虫性腹泻及非传染性腹泻，预防和治疗难度大[2]。因此寻找一种非特异性止泻药物成为目前亟待解决的问题之一。

中草药在腹泻病防控方面具有一定潜力，多种传统单味中药及方剂已被证明具有涩肠止泻作用[3]。同时，中药在治疗猪腹泻病上具有副作用小、耐药性低、药物无残留等优点[4]。甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflataBat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabraL.）干燥根和根茎，味甘性平，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳等功效，可与其他药物连用止泻[5]。异甘草素作为甘草提取物，已证明具有抗菌、抗病毒和增强免疫、减轻炎症作用[6-7]。因此，异甘草素作为一种非特异性抗腹泻药物应用前景良好。

中药治疗疾病是“多成分、多途径、多靶标”协同作用，无法从单一方面阐明其治疗疾病的具体机制[8]。网络药理学是一门新兴学科，通过整合多种组学、高通量筛选、分子交互验证、网络可视化分析等相关技术揭示“药物-基因-靶标-疾病”之间复杂的网络关系，阐明药物作用机理，已成为研究创新药物重要途径。网络药理学可通过整理归纳现有数据库中信息，分析中药与疾病之间相互关系[9]。

本研究利用蓖麻油诱导小鼠腹泻模型评价异甘草素抗腹泻活性，再利用网络药理研究方法探讨异甘草素治疗腹泻关键靶标，基于分子对接技术验证异甘草素与靶标结合作用，揭示异甘草素治疗腹泻潜在分子机制，为临床应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本试验所用昆明白鼠购自哈尔滨医科大学，雌雄各半。

1.2 试验药品

异甘草素标准品（PHLC≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；蓖麻油（货号：C6770）购自北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓖麻油诱导小鼠腹泻

取昆明白鼠50只，体重为18～22 g，雌雄各半，随机分成5组，每组10只，灌胃给药，试验分为空白对照组、腹泻对照组、异甘草素（50mg.kg-1）低剂量组、异甘草素（100 mg.kg-1）中剂量组和异甘草素（200 mg.kg-1）高剂量组。试验前24 h禁食，异甘草素低、中、高剂量组分别口服灌胃异甘草素0.2 mL，空白对照组和腹泻对照组口服灌胃含0.1%DMSO生理盐水0.2 mL。0.5 h后，分别灌胃0.2 mL蓖麻油，空白对照组灌胃0.2 mL生理盐水，试验观察6 h，记录各组小鼠精神和生理状态及各组小鼠初次腹泻时间和次数。

另取50只昆明白鼠，体重为18～22 g，雌雄各半，随机分成5组，试验分组与处理方式同上，用适量碳粉代替蓖麻油灌胃，1.5 h后处死小鼠，记录并计算各组小鼠肠道内碳粉推进比。

肠道碳粉推进比计算公式为：推进比=碳粉推进长度/肠管总长度×100%。

1.3.2 网络药理学分析

1.3.2.1 异甘草素及腹泻疾病靶标的检索

在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP数据库，https://www.tcmspw.com/tcmsp.php）中检索与异甘草素相关靶标。将“Diarrhea”作为检索词，在GeneCards在线数据库（https://www.genecards.org/）中检索腹泻已知相关疾病靶点，得到腹泻疾病靶点。将异甘草素相关蛋白与腹泻相关靶标作对比，寻找两者交集靶标，确定异甘草素治疗腹泻潜在靶点。

1.3.2.2 PPI靶蛋白互作网络构建

利用STRING平台（https://string-db.org/）构建交集靶点蛋白质-蛋白质互作网络（PPI），分析异甘草素治疗腹泻靶标相互关系。将所有交集蛋白导入至STRING平台，选择“多重蛋白”分析，物种选择为“mus”，根据结果选择编码相应蛋白基因名称，生成蛋白互作网络，分析网络关联度及蛋白富集系数，确定异甘草素治疗腹泻中调控关键蛋白。

1.3.2.3 基因本体论（Geneontology，GO）分析

将筛选出的交集靶点基因导入WebGestalt在线工具，对交集靶点作GO富集分析，将物种与背景设定为“mus”，根据P＜0.05描述蛋白质显著程度，分析交集靶标所集中的生物学过程，探讨异甘草素治疗腹泻所影响的分子通路。

1.3.2.4 KEGG通路富集分析

与GO分析原理相同，将筛选出的靶点导入WebGestalt在线工具，对交集靶点作KEGG富集分析，将物种与背景设定为“mus”，根据P＜0.05描述显著程度，得到异甘草素治疗腹泻疾病主要作用通路，分析显著通路。

1.3.3 分子对接

在PDB数据库（https://www1.rcsb.org/）检索关键蛋白晶体结构，利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索异甘草素3D结构。利用Discovery situido 2016作分子对接，采用C-CDOCK半柔性对接，计算异甘草素与关键靶标相互作用潜在结合构想和结合能，确定潜在异甘草素与关键靶标相互作用模式。

1.3.4 荧光定量PCR

取昆明白鼠10只，体重为18～22 g，雌雄各半，随机分成两组，每组5只，分别为健康对照组、异甘草素组。异甘草素组口服灌胃0.2 mL 200 mg.kg-1异甘草素溶液，对照组灌胃等量生理盐水。6 h后，处死小鼠，取各小鼠肠段组织研磨，利用RNA提取试剂盒提取组织中RNA，再利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，通过NovoStart®SYBRqPCR SuperMix Plus法实时荧光定量检测系统作qPCR。所用引物见表1。将上述体系加于0.1 mL八联管内，混匀后瞬离上机。反应体系为：水（RNase-Free ddH2O）5μL，上、下游引物（10μmol.L-1）各0.5μL，预混染料（NovoStart®SYBR qPCR SuperMix Plus）10μL，模板（cDNA）4μL，共计20μL。反应程序为：95℃30 s；95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，40个循环；92℃5 s，60℃1 min，95℃continues；50℃30 s。反应结束后，读取Ct值，运用ΔΔCt法分析数据。确定异甘草素对MAPK14、NCOA2、PPARG和ESR1基因表达的影响。

表1 荧光定量PCR引物Table1 Primersfor quantitative PCR reactions

1.3.5 统计分析

所有试验均开展3次独立重复试验，使用Excel 2016和SPSS 19.0软件对数据作统计学分析，P＞0.05表示无显著性差异，不标记；0.01＜P＜0.05表示显著性差异，以*标记；P＜0.01表示极显著性差异，以**标记。

2 结果与分析

2.1 异甘草素对蓖麻油小鼠腹泻的治疗作用

本研究通过蓖麻油诱导小鼠腹泻模型评价异甘草素抗腹泻作用，腹泻对照组小鼠试验开始后6 h精神沉郁，不喜运动，四肢蜷缩，小鼠被毛粗乱；用药组小鼠精神状态良好，生理状态正常，与空白对照组相比无明显差异。如图1所示，与腹泻对照组相比，异甘草素显著降低小鼠腹泻次数（P＜0.05），延缓小鼠初次腹泻时间（P＜0.05），且呈一定剂量依赖。同时，与腹泻对照组相比，异甘草素还可显著抑制肠道蠕动（P＜0.05），延缓碳粉推进距离，减少腹泻发生。试验结果表明异甘草素对蓖麻油诱导小鼠腹泻具有良好治疗作用。

图1 异甘草素对蓖麻油诱导的小鼠腹泻治疗作用Fig.1 Effect of isoliquiritigenin on castor oil induced diarrhea in mice

2.2 网络药理学分析

基于数据检索，在TCMSP数据库中共找到与异甘草素相关蛋白靶标34个，在GeneCards在线数据库共找到与腹泻相关靶标蛋白5 686个，其中交集靶标共计14个，蛋白名称如表2所示。这些交集靶标与腹泻的发生和异甘草素均具有一定相关性，可能是异甘草素治疗腹泻的靶标。

表2 交集靶标信息Table 2 Intersection target information

将上述交集蛋白名称导入至STRING平台，通过STRING平台构建蛋白互作网络，种属选择为“mus”。试验结果见图2，共有4个蛋白与其他蛋白无关联，其余蛋白与网络中其他蛋白均产生紧密相关性，网络中蛋白节点数为13，网络预期边数为5，共产生17条边，平均节点度为2.62，PPI富集P值为1.11×10-5，表明网络中蛋白与蛋白高度关联，其中有丝分裂活化蛋白激酶14（MAPK14）、核受体辅活化因子2（NCOA2）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARG）及雌激素受体1（ESR1）在PPI中节点数最高，为关键蛋白。异甘草素可能通过影响上述4个关键蛋白活性或调节关键蛋白表达，进而影响整个网络，达到治疗腹泻目的。

图2 交集靶标蛋白互作图Fig.2 PPI of intersection target

2.3 KEGG分析

对上述靶标基因作富集分析，KEGG分析结果见图3，这些蛋白主要参与成纤维细胞增值通路调节、平滑肌细胞凋亡过程调节及应激反应等相关生物学过程，表明异甘草素可能通过上述基因通路和生物学过程，达到治疗腹泻目的。

图3 KEGG分析Fig.3 KEGG analysis

2.4 GO分析

对异甘草素治疗腹泻的相关靶标作GO基因富集分析，试验结果如图4所示，不同颜色分别代表不同富集类别，红色代表生物学过程、蓝色代表细胞成分、绿色代表分子功能。

图4 GO分析Fig.4 GO analysis

结果表明这些靶标基因与应激反应、生物学运动及细胞信息传递等生物学过程紧密联系。同时，这些靶标基因参与细胞质和细胞核物质调控，与蛋白互作及细胞信息传递高度相关。

2.5 分子对接

基于网络药理学分析，找到异甘草素治疗腹泻的4个关键靶标，分别为MAPK14、NCOA2、PPARG以及ESR1。通过分子对接分析异甘草素与4个关键靶标结合作用。如图5所示，异甘草素分别有效占据4个蛋白活性腔内，异甘草素在该结构域内与底物存在竞争关系，抑制蛋白功能。异甘草素与4个蛋白结合能分别为-30.25、-42.65、-37.64和-46.56 KJ.mol-1。表明异甘草素可自发与4种蛋白产生结合，是靶标潜在竞争性抑制剂。

2.6 异甘草素对靶标基因表达的影响

为进一步验证异甘草素与关键靶标关系，利用荧光定量PCR检测异甘草素对关键靶标基因表达的影响。异甘草素显著下调MAPK14、NCOA2、PPARG及ESR1基因表达，结果见图6。表明异甘草素通过影响关键靶标基因表达调控腹泻相关通路，达到治疗腹泻的作用。

图6 异甘草素对关键靶标基因表达的影响Fig.6 Effect of isoglycyrrhizin on the expression of key target genes

3 讨论

异甘草素具有良好抗腹泻效果，可显著降低腹泻次数，延缓初次腹泻时间，作为一种非特异性抗腹泻药物具有一定开发前景[10-11]。为更好探究异甘草素抗腹泻作用机制，本文通过网络药理学和分子对接方法寻找异甘草素治疗腹泻关键蛋白。网络药理学是借助网络研究药物-靶标-疾病之间关系，基于现有数据信息再次整合，挖掘药物治疗疾病药理作用的研究方法[12]。本研究探讨异甘草素治疗腹泻的关键靶标和关键通路，结果表明MAPK14、NCOA2、PPARG和ESR1可能是异甘草素治疗腹泻关键蛋白。同时，本研究利用荧光定量技术确定异甘草素对上述关键靶标基因的影响。白东东等利用网络药理学方法分析白头翁治疗腹泻分子机制，确定雌激素受体1（Estrogen receptor，ESR1）、CREB结合蛋白（CREB binding protein，CREBBP）等gned45个关键靶标[13]，与本研究结果相似。在异甘草素治疗腹泻关键靶标中，MAPK14在结肠炎中具有重要调节作用，研究表明蓖麻油可对肠黏膜产生强烈刺激，引起肠道炎症导致动物腹泻[14]。此外，研究表明NCOA2参与肠道胆汁酸相关通路调节，与结肠炎发生和发展相关[15]。PPARG主要存在3个亚型，多在脂肪组织内表达，参与胆固醇和脂质代谢等生物学过程，对肠道内微环境有一定调节作用，与腹泻发生相关[16]。分子对接技术是目前筛选和设计靶向性药物的有效手段，为药物研发提供重要数据支撑和试验依据。通过计算机模拟技术进行分子对接已成为药物研发主要途径[17]。在本研究中利用Discovery Stiudio 2016进行半柔性对接，小分子可根据键转角合理改变构象，使结果更加准确。分子对接结果显示异甘草素能够有效与MAPK14、NCOA2、PPARG以及ESR1产生结合，结合能均为负值，说明异甘草素可通过抑制上述关键靶标活性影响腹泻相关生物学通路，治疗腹泻。

KEGG和GO基因富集分析是分析“药物-靶标-通路”有效手段，KEGG分析结果表明交集蛋白与成纤维细胞增值的信号通路调节高度相关，成纤维细胞是疏松结缔组织的重要细胞成分，对维持黏膜固有层和黏膜下层结构具有重要生理作用[18]。表明异甘草素可通过调控成纤维细胞增殖维持肠道管壁结构的稳定，防止腹泻发生。GO分析结果显示交集靶标与应激反应相关，而造成腹泻原因之一是机体对环境改变而产生应激反应[19]，表明异甘草素可通过控制应激反应发生降低机体发生腹泻情况。GO分析结果显示异甘草素与离子之间相互作用有关，造成腹泻发生最直接原因是肠道内无机盐离子失衡，异甘草素可通过抑制关键蛋白，引起相关基因表达，辐射至整个信号通路，影响胃肠道内环境，延缓腹泻发生。基于网络药理学和分子对接研究，表明异甘草素可能通过维持肠道内环境，降低炎症反应，起抗腹泻作用。

综上所述，异甘草素作为抗腹泻药物具有良好开发前景。本研究基于网络药理学和分子对接，分析异甘草素治疗腹泻的潜在靶标及可能影响的生物学过程，初步探讨其抗腹泻分子机制，为后续异甘草素抗腹泻研究奠定理论基础。