放牧对高寒草甸植被-土壤酚类物质组成及含量的影响

陈 玲，王璐慧，国 慧，杨振安 2

（1. 西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川 南充 637009；2. 西华师范大学生命科学学院，四川 南充 637009；3. 西华师范大学实验室与设备管理处，四川 南充 637009）

酚类物质是植物体内重要的次生代谢产物，其含量不仅影响牧草的适口性和营养价值，还可以通过凋落物、根系分泌物等形式进入土壤[1-2]，酚类物质在土壤中大量积累后形成“酚(酶)闩”效应，进而影响生态系统物质循环和周转[3]。同时，酚类物质也是植物体内重要的化学防御物质，当植物受到外来伤害等影响时，酚类物质就会在植物体内大量积累[4]。放牧时牲畜的啃食和践踏必然会对植物酚类物质产生影响，进而影响到植被-土壤系统的物质周转和循环。众多学者通过大量的研究揭示了放牧对草甸植被和土壤的影响，但这些研究主要集中在植被群落特征[5-7]、生产力[7-9]、植物功能性状[10]、土壤属性[6,11](理化、生物等)及植被土壤相互作用[11]等方面，而对植物体和土壤酚类物质的研究较少。因此系统而深入地研究放牧对草甸植被酚类物质的影响，探明在放牧和围封条件下植物-土壤酚类物质的含量和组成具有重要意义。

土壤酚类物质主要来源于地表植物，通过3 种途径进入土壤：植物根系分泌[12]；植物残体及其凋落物分解；雨露等对植物体表面分泌物的淋洗。放牧过程中动物的啃食、践踏等机械行为会影响植物酚类物质含量，进而间接影响进入土壤中的酚类物质含量。同时，在微生物的作用下，酚类物质可以被分解为简单小分子及其衍生物[13]，如酚氧化酶能将多酚氧化分解为简单化合物[14]，而pH以及氧含量等能影响微生物和酚氧化酶活性[15-16]，进而影响土壤酚含量。此外，酚类物质具有较强的抗氧化性和生物毒性[17]，会抑制土壤微生物代谢活动和酶活性[18]，进而影响土壤生态系统中的物质周转和循环。基于酚类物质在土壤中的重要调控作用及放牧对土壤酚含量可能存在的潜在影响，有必要探明放牧条件下土壤酚的积累规律，对于维持和保护草甸生态系统的可持续发展具有重要作用。

本研究以长期放养牦牛(1980-2020 年)和围封(2014-2020 年)的高寒草甸为研究对象，分析放牧和禁牧对植被群落组成、植被(地上和地下部分)和土壤中酚类物质(总酚、简单酚和单宁)的影响，以期明确不同草地利用方式下植被和土壤酚类物质含量变化，进而揭示酚类物质对生态系统中物质周转和循环的影响(限制)，为高寒草甸的合理利用提供新的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验区域

试验区域位于四川省阿坝藏族羌族自治州红原县瓦切镇境内。该地区属高原寒冷气候类型，年均气温1.57 ℃，平均海拔3 480 m。全年最冷月为1 月，平均气温为-9.66 ℃；最热月为7 月，平均气温为11.12 ℃；1961-2015 年年平均降水量752.21 mm(气象数据来源于中国气象数据网http://data.cma.cn/)。试验区域主要优势物种为垂穗披碱草(Elymus nutans)、问荆(Equisetum arvense)、条叶银莲花(Anemone coelestinavar.linearis)、 马先蒿(GrexPedicularis)、鹅绒委陵菜(Potentilla anserina)、紫羊茅(Festuca rubra)等。

1.2 试验设计

本研究中所选取的高寒草甸(102°37′08″ E，32°57′50″ N)约0.4 km2，自1980 年以来一直是自由放牧牦牛的冬季牧场(11 月至翌年4 月)。在2014 年4 月将该区域分为两部分，一半(约0.2 km2)继续作为冬季牧场使用(grazing, G)，另一半(约0.2 km2)进行封育(grazing prohibition, GP)。2020 年7 月下旬在放牧和禁牧的样地内，按照对角线法选取6 个1 m × 1 m 的样方进行植被调查(每块样地间隔不小于20 m)，记录样方内植物种类、丰富度、盖度、高度等信息。待植被调查结束后，在1 m × 1 m的样方内选择1 个0.5 m × 0.5 m 的小样方，将其植被地上部分全部收获带回实验室，用于计算植物地上生物量；同时，用内径为8 cm 的土钻采集5 个0 -30 cm 土柱用于估算植物地下生物量。用直径为5 cm 的土钻在0.5 m × 0.5 m 的小样方内钻取5 个0 -30 cm 的土柱(按0 - 10、10 - 20 和20 - 30 cm分割)带回实验室，用于测定土壤酚类物质含量。

1.3 样品分析测定

1.3.1 植物样品测定

植物样品(地上、地下)在避光低温下(≤ 40 ℃，避免温度过高影响样品中单宁含量)烘干后用粉碎机(FZ102，科恒)粉碎，过0.850 mm 筛用于测定植物体酚类物质含量。采用超声辅助法提取植物总酚，即分别称取植物地上、地下部样品粉末各2.0 g 置于25 mL 具塞锥形瓶中，先加入10 mL 70%乙醇溶液，以540 W、40～50 ℃超声提取3 次，每次30 min，合并提取液，5 000 r·min−1下离心15 min，抽滤，得滤液，低温避光条件下保存备用。取0.05 mL (根据被测物的含量多少可相应调整取样量)相同体积的提取液加入小试管中，用蒸馏水稀释并定容至1 mL，加入0.5 mL Folin-Ciocalteu 试剂和1 mL 碳酸钠溶液(15%)，摇匀，静置1 h，在波长750 nm 下比色[19]。

简单酚含量测定：称取100 mg 不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)，置于10 mL 试管中，加入1.0 mL蒸馏水，然后加入1.0 mL 植物提取液，用旋转振动仪震荡试管，在常温冰箱中放置15 min，再次震荡试管，3 000 r·min−1下离心15 min。取上清液加入Folin-Ciocalteu 试剂显色，在波长725 nm 下比色，测定简单酚含量。用没食子酸作标准品。

单宁含量＝总酚含量-简单酚含量[19]。

1.3.2 土壤样品测定

土壤总酚含量用Folin-Ciocalteu 比色法在紫外-可见光分光光度计上进行测定。取2 g 过0.075 0 mm筛的风干土，置于50 mL 容量瓶中，加入4 mol·L−1硫酸10 mL 于110 ℃恒温干燥箱中提取24 h。用50 mL蒸馏水定容，摇匀，过滤，取滤液。将0.5 mL 样品溶液加入2 mL 离心管中。加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，搅拌均匀，静置3 min 后，加入1 mL 15%Na2CO3溶液，摇匀，静置1 h。如有沉淀，离心4 min。取上清液并在750 nm 处测定吸光值[19]。土壤简单酚以及单宁含量的测定和计算同上。

1.4 数据分析

所有的数据经直方图检验均服从正态分布和同质性，使用Bartlett 检验各样本方差齐性。用单因素方差分析比较放牧和围封对植被指标的影响，用双因素方差分析(放牧和禁牧、土层深度)比较土壤酚类物质含量的差异显著性。用SPSS 22.0 进行数据分析，所有数据均用平均值 ± 标准误表示。

2 结果与分析

2.1 放牧对植被群落特征的影响

放牧与禁牧条件下植被群落特征(表1)显示：群落物种数(P= 0.357)和盖度(P= 0.643)在放牧和禁牧处理下无显著差异，但植被群落的物种组成和优势种却发生了明显变化。在放牧处理下，禾本科类的优质牧草[垂穗披碱草、发草(Deschampsia caespitosa)、甘青剪股颖(Agrostis hugoniana)、羊茅(Festuca ovina)、草地早熟禾(Poa pratensis)]大量减少，盖度由28.00%降低至11.33%；毛茛科[高原毛茛(Ranunculus tanguticus)、小花草玉梅(Anemone rivularis)、翠雀(Delphinium grandiflorum)]、蔷薇科[翻白委陵菜(Potentilla discolor)、 鹅绒委陵菜(Potentilla anserina)、山莓草(Sibbaldia procumbens)、二裂委陵菜(Potentilla bifurca)]以及蓼科[圆穗蓼(Polygonum macrophyllum)、 珠 芽 蓼 (Polygonum viviparum)]等杂草在放牧作用下迅速生长，盖度明显增加。

表1 放牧与禁牧条件下植被群落特征Table 1 Characteristics of the vegetation community under grazing and grazing prohibition conditions

2.2 放牧对植物群落生物量及其酚类物质含量的影响

分析发现，放牧显著降低植物群落地上部分生物量(P< 0.001)和简单酚含量(P= 0.018)，分别减少了40.27%和28.48%；却显著增加了植物群落地上部分总酚(P= 0.012)和单宁含量(P< 0.001)，分别增加了47.89%和92.91% (图1)。

放牧显著减少了植物地下部分生物量(P=0.002)，减少了23.45%，却显著增加了植物群落地下部分总酚(P= 0.040)和单宁含量(P< 0.025)，分别增加了122.31%和127.56%；而对植物群落地下部分简单酚含量的影响不显著(P= 0.369) (图1)。由此可知，植被群落地上生物量明显低于地下部分，而地上部分酚类物质含量却明显高于地下部分。

图1 放牧和禁牧处理对植物地上和地下部分生物量和酚类物质含量的影响Figure 1 Effect of grazing (G) and grazing prohibition (GP) treatment on the biomass and concentration of polyphenols in the above- and belowground part of plant

2.3 放牧对土壤酚类物质含量的影响

分析发现，放牧显著降低了0 - 30 cm 土壤总酚(P= 0.002)和单宁含量(P= 0.001)，却对简单酚含量无显著影响(P= 0.190) (表2)。同时，不论是在放牧还是在禁牧处理下，0 - 30 cm 土壤总酚、简单酚和单宁含量均呈现出随着土壤深度增加而降低的变化趋势；土层对总酚含量(P< 0.001)、单宁含量(P<0.001)及简单酚含量(P< 0.05)均存在显著影响。二者互作对土壤酚类物质含量均无显著影响(P> 0.05)。

表2 放牧和禁牧处理对0 - 30 cm 土壤酚类物质含量的影响Table 2 Effect of grazing and grazing prohibition treatment on the concentration of polyphenols of 0 - 30 cm soil

3 讨论与结论

3.1 植被群落结构变化

植被群落结构与高寒草甸生态系统的稳定、物质循环和能量流动有着紧密联系[20-21]。放牧时在牛羊啃食及践踏等作用影响下，植被群落必将受到影响。本研究发现，在放牧影响下禾本科植被盖度降低，而毛茛科、蔷薇科以及蓼科等杂类草的盖度则明显增加(表1)。在禁牧处理下，没有放牧牲畜的采食与践踏，个体高大的禾本科植物(如垂穗披碱草、发草、甘青剪股颖、紫羊茅、草地早熟禾等)比矮小植物(如翻白委陵菜、鹅绒委陵菜等)更具竞争优势，更易获取足够的光照，进而生长加快，从而导致部分杂草消失，丰富度降低[22-23]。但本研究放牧处理下丰富度的改变与前人所发现的禁牧样地内植物群落盖度显著高于自由放牧样地的结果不一致[24]，这可能与禁牧时间有关。有研究表明，长期禁牧会加剧植物物种间的竞争，导致竞争优势较低的物种得不到充分的水肥以及阳光等，进而降低植物种群丰富度[25]。

本研究发现，植被群落地上、地下生物量由于放牧的影响而显著下降(图1)，这与前人研究结果一致[24,26]。放牧导致植被群落生物量降低，主要是因为牦牛的采食作用[26]，其次是牦牛的践踏导致土壤紧实，大量植物种子难以正常萌发，植物根系也难以生长，导致地上、地下生物量均显著降低[27]；并且由于植被群落盖度以及高度的降低，导致大量土壤直接接触外界环境，加速土壤沙化[28]，降低草甸的初级生产力。植被作为高寒草甸生态系统的初级生产者，对于稳定高寒草甸生态功能和维持碳稳定具有重要作用。放牧处理促使高寒草甸植被生物量降低，这可能会严重影响草甸土壤碳储量。综上，放牧处理下，禾本科植物大量减少，毛茛科以及其他杂类草植物大量增加，最终导致丰富度增加，同时植被群落盖度降低。且在放牧处理下主要功能群(毛茛科、禾本科)植株高度降低，地上、地下生物量均显著降低。

3.2 植物群落酚类物质含量的变化

单宁等酚类物质是植物体重要的次生代谢产物，其含量因外界环境(如牦牛的啃食和践踏作用等)变化而发生明显的变化[29-30]。本研究发现，在放牧处理下植物群落总酚和单宁含量显著增加(图1)，这一结果与前人的研究结果一致[30]。不仅因牲畜的啃食作用促进了植物体次生代谢产物(酚类物质)含量增加，而且酚类物质含量因植物种类不同亦呈现出差异性，因此植被群落结构改变必然会引起植物群落酚类物质含量发生变化[31]。

此外，植物群落地上部分的酚类物质含量显著高于地下部分，这说明植物群落酚类物质主要集中在地上部，如叶片、果实以及种皮等，而在地下部根系组织分布较少[32]。植物群落酚类物质(如单宁)含量改变，不仅仅会影响牧草的适口性，还会降低其营养价值[29]。植物群落单宁等酚类物质含量的改变可能是植物体对放牧活动的一种响应，在一定程度上减少牲畜的采食，以确保其在群落中保持优势。此外植物群落酚类物质具有多种化学特性，在维持土壤碳稳定方面具有重要作用[3]。土壤酚类物质主要来源于植物，因此植物群落酚类物质含量波动必将影响土壤酚类物质含量，进而影响土壤生态系统稳定。综上，放牧处理下植物群落总酚以及单宁含量显著增加，植物群落地上部分简单酚含量显著降低，植物群落地下部分简单酚含量无显著变化。

3.3 土壤酚类物质含量的变化

酚类物质在抑制土壤有机碳分解方面具有十分重要的作用，而植物根系分泌物是土壤酚类物质的重要来源之一[2]，酚类物质从植物体经根系分泌、凋落物分解等途径进入土壤，在土壤中大量积累[12-13]。高浓度酚类物质的“闩锁”作用[3]，对于高寒草甸生态健康具有十分重要的作用。植物群落作为土壤酚类物质的主要来源，是影响土壤有机碳的关键[33]。本研究发现，放牧增加了植物群落酚类物质(总酚、单宁)含量，却减少了土壤酚类物质(总酚、单宁)含量。这可能是因为牲畜啃食植物，减少了进入土壤的凋落物生物量[34]。加之，植物凋落物分解是土壤酚类物质的主要来源之一[1]，因此生物量减少必然会导致植物群落向土壤输入酚类物质的能力降低。其次在放牧影响下大量植物被啃食，导致土壤裸露在大气环境中，形成富氧环境，促进酚氧化酶活性增加，从而加速酚类物质分解。这也说明，放牧虽然增加了植物群落酚类物质(总酚、单宁)含量，但土壤酚类物质含量不仅仅与植物体酚类物质含量有关，还与植物生物量以及土壤环境等密切相关。因此，对土壤酚类物质的研究不仅要关注地表植被，还应该关注土壤环境的变化。

综上，放牧过程中，牦牛的啃食及践踏等因素会改变植物体次生代谢产物(酚类物质)的组成和含量，并进一步影响土壤环境中酚类物质含量。通过研究发现，放牧有利于促进植物群落酚类物质的积累，增加植物体抵御外界环境的能力；但在放牧作用下，土壤酚类物质(总酚、单宁)含量显著降低，对于土壤生态系统碳稳定性可能具有不利的影响[3]；加之，放牧导致植被群落结构明显改变，生物量、盖度等降低，也不利于土壤有机碳的积累[28]。因此，本研究认为，放牧可能通过改变植被物种结构组成和生物量及土壤酚类物质含量等来影响草甸土壤碳动态，但是这还需要通过进一步的研究来获得可靠的证据。