血清学联合核酸检测在承德市无偿献血者血液筛查中的应用研究

周静江 刘明丽

血液输注能快速补充血容量，改善组织细胞缺血缺氧状态，已成为临床上抢救急性大出血、严重创伤烧伤、器官移植等疾病的主要治疗手段，但输血同时也是导致HIV、HBV、HCV、TP等输血相关病原体传播的重要途径[1,2]。因此，如何降低经输血传播HIV、HBV、HCV风险，提高输血安全，已成为采供血机构的工作重点和难点。目前，采供血机构血清学输血传播病原体筛查项目包括HBsAg、抗-HCV抗体/抗原、抗-HIV抗体/抗原、抗-TP等，但由于检测试剂窗口期的存在以及灵敏度的限制、献血者免疫沉默、病毒突变等原因会导致部分阳性标本的漏检[3,4]。核酸检测(nucleic acid testing,NAT)因其直接检测病毒体核酸成分，具有较高灵敏度和特异性，能有效缩短HIV，HCV 和 HBV检测的 “窗口期”，防止低病毒载量标本的漏检，提高血液安全[5,6]。我国2015版《血站技术操作规程》明确规定将 NAT作为采供血机构常规筛查方法及病毒核酸筛查全覆盖[7]，因此，血清学联合核酸检测成为各采供血机构的常规病原体筛查模式。为了探究开展血液标本核酸检测对于提高输血安全的意义，本研究收集承德市中心血站无偿献血者标本，分析其免疫血清学检测、血清学联合核酸检测筛查阳性率的不同，现将研究结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 调查对象 选择承德市中心血站2018年1月至2019年12月采集的77 886份无偿献血者血液样本作为研究对象。所有献血者符合《献血者健康检查要求》的相关规定：体重男≥50 kg，女≥45 kg；90 mm Hg≤收缩压<140 mm Hg,60 mm Hg≤舒张压<90 mm Hg；脉搏60次/min～100次/min(高度耐力运动员≥50次/min)；血红蛋白含量(硫酸铜目测法)男≥1.0520，女≥1.0510；丙氨酸氨基转移酶(干化法)检查结果正常；乙型肝炎病毒表面抗原(金标法)呈非反应性；不具有任何一条献血禁忌症。满足以上指标者方能进入采血环节。

1.2 仪器与试剂 STAR全自动加样仪(瑞士HAMILTON公司)，FAME全自动酶免分析系统(瑞士HAMILTON公司),sunrise酶标仪(瑞士TECAN公司)，ABI7500荧光定量PCR仪、人类免疫缺陷病毒(HIV RNA)-丙型肝炎病毒(HCV RNA)-乙型肝炎病毒(HBV DNA)核酸检测试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司),HBsAg检测试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)、抗-HCV抗原抗体联合诊断试剂盒(北京万泰生物制药有限公司)、抗-HIV抗原抗体联合诊断试剂盒(北京万泰生物药业股份有限公司)、抗TP检测试剂盒(珠海丽珠试剂有限公司)。所有检测试剂均为国家合格产品且在有效期内使用。

1.3 血液标本的检测

1.3.1 血清学检测:采用两种不同厂家的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒对本血站2018年1月至2019年12月采集的77 886份无偿献血者血液样本进行HBsAg、抗-HCV抗原/抗体、抗-HIV抗原/抗体、抗-TP的血清学筛查，检测过程严格按照试剂盒操作说明和实验室的标准操作规程进行。结果判读：初次筛查如两种ELISA试剂检测结果均呈非反应性，判定该标本为阴性；如均呈反应性，判定该标本为阳性。如一种检测试剂呈反应性，另一种试剂为非反应性，则将该标本采用呈反应性的检测试剂进行双孔复检，若结果显示单孔或双孔存在反应性，则判定该标本的血清学检测结果为单试剂阳性，若双孔均呈非反应性，则判定该标本血清学检测结果为阴性。

1.3.2 核酸检测:采用唐山启奥软件信息管理系统Shinow 9.0(唐山启奥科技有限公司)对无偿献血者血液标本的血清学检测结果进行筛查,将血清学筛查阴性和单试剂阳性标本进行病毒核酸检测。本实验室采用8∶1核酸混合检测模式，即将8个血液标本混合在一个汇集管内，然后再进行病毒核酸的提取、纯化，扩增体系的配置，最后采用TaqMan荧光探针PCR扩增技术对血清学筛查阴性和单试剂阳性标本进行HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA核酸检测。结果判读 ：若核酸混检呈非反应性，则判定标本为阴性，如呈反应性则进行拆分检测，拆分结果若为非反应性，判定该标本为阴性，如呈反应性，则判定标本为阳性。注意：核酸标本采集后应尽快检测，从采集到完成检测需<72 h。核酸检测过程严格按照试剂盒操作说明和实验室的标准操作规程进行。

1.4 观察指标 (1)观察77 886份无偿献血者血液样本的血清学结果： HBsAg、抗-HCV抗原/抗体、HIV抗原/抗体、抗-TP单试剂和双试剂阳性例数，计算各检测项目不合格率以及总体不合格率。(2)比较HBV、HCV、HIV三种检测项目血清学筛查阳性率、血清学与核酸联合筛查阳性率的不同。(3)血清学单试剂阳性标本核酸检测结果，分析血清学筛查结果与核酸筛查结果的符合率。(4)血清学筛查阴性标本的核酸检测结果，分析血清学筛查试剂的漏检率。

1.5 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件，计数资料以百分率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 献血者标本血清学筛查结果 经两种不同ELISA试剂检测共筛查出不合格标本752例，不合格率0.966%。其中， HBsAg阳性共228例，包括单试剂阳性184例，双试剂阳性44例；抗-HCV抗原/抗体阳性共132例，包括单试剂阳性66例，双试剂阳性66例；HIV抗原/抗体阳性共104例，包括单试剂阳性76例，双试剂阳性28例；抗-TP阳性共288例，包括单试剂阳性95例，双试剂阳性193例。见表1。

表1 献血者标本血清学筛查结果 例

2.2 献血者标本血清学筛查阳性率、血清学联合核酸筛查阳性率比较 献血者标本HBV、HCV、HIV血清学筛查阳性率分别为0.293%、0.169%、0.134%，差异有统计学意义(χ2= 54.798，P=0.000)；献血者标本HBV、HCV、HIV血清学与核酸联合筛查阳性率分别为0.311%、0.178%、0.137%，差异有统计学意义(χ2= 61.312，P=0.000)。见表2。

表2 献血者标本血清学筛查阳性率、血清学联合核酸筛查阳性率比较

2.3 血清学筛查单试剂阳性标本的核酸检测结果 献血者标本HBV、HCV、HIV血清学筛查单试剂阳性例数分别为184例、66例、76例，再经核酸检测呈阳性反应例数分别为2例、0例、3例。血清学筛查试剂与核酸检测试剂筛查阳性符合率分别为1.09%、0、3.95%。见表3。

表3 血清学筛查单试剂阳性标本的核酸检测结果

2.4 血清学筛查阴性标本的核酸检测结果 77 886例献血者标本经两种不同厂家血清检测试剂HBV、HCV、HIV筛查，呈非反应性的标本例数分别为77 658例、77 754例、77 782例，阴性标本再经HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA核酸检测呈反应性样本例数分别为14例、7例、3例，血清学试剂筛查漏检率分别为 0.018%、0.009%、0.004%，三者比较差异有统计学意义(χ2= 7.771，P=0.021)。见表4。

表4 血清学筛查阴性标本的核酸检测结果

3 讨论

降低输血相关病毒传播风险，提高输血安全，已经成为采供血机构、医疗行业甚至全社会关注的焦点。因此，如何提高阳性标本检出率、降低经输血传播病毒残余风险目前已成为各采供血机构持续改进的工作重点和难点。酶联免疫吸附试验是我国采供血机构普遍使用的血液筛查技术，尤其随着近几年ELISA检测试剂的不断更新换代，其稳定性的不断提高，实验室血清学筛查技术在在降低经血HBV、HCV、HIV等病原体传播，保障输血安全上更是发挥着重要作用。尽管ELISA检测试剂的灵敏度经过不断改进，得到很大提高，但仍然无法避免病毒检测窗口期的存在，HBV窗口期为56 d、HCV为72 d、HIV为22 d，加之病毒亚型、病毒变异、患者免疫沉默等情况的存在，必然会导致弱阳性标本尤其是窗口期标本的漏检[8]，这给输血安全带来严重威胁。此外，ELISA检测试剂的低特异性，也会导致假阳性结果的增加，献血者献血资格的淘汰，这不仅浪费了宝贵的血液资源，同时也对献血者的献血爱心带来不利影响。核酸扩增技术是直接检测病毒核酸的一系列技术的总称，该检测技术具有高度的灵敏度和特异性。研究表明：对无偿献血者血液标本进行核酸检测，可将HBV、HCV、HIV的感染窗口期分别缩短至为41 d、12 d和11 d[9,10]，并可防止低病毒载量标本及隐匿性乙型肝炎感染(occult HBV infection,OBI)的漏检[11,12]。我国于2016年实现无偿献血核酸检测全覆盖。目前，国内采供血机构的核酸检测模式主要有混样检测和单人份检测两种模式，混样检测一般在去除血清学筛查阳性标本后进行，单人份检测一般与血清学检测同时进行。承德市中心血站采用8人份混样模式对献血者标本进行核酸检测。本研究通过观察承德市中心血站献血者标本免疫血清学检测阳性率、血清学联合核酸检测筛查阳性率的不同，分析核酸检测对于提高血液安全，降低输血风险的重要意义。

HBV、HCV、HIV是我国采供血机构常规病原体筛查项目，本研究的77886无偿献血者标本经HBV、HCV、HIV血清学筛查呈阳性反应标本例数分别 228例、132例、104例、筛查阳性率分别为0.293%、0.169%、0.134%， 血清学联合核酸检测阳性率分别为0.311%、0.178%、0.137%，HBV、HCV、HIV的筛查阳性率均呈现HBV>HCV> HIV的趋势，这与我国人群HBV、HCV、 HIV三种病毒的流行率相吻合，与刘丽等[13,14]的研究得出的HBV、HCV、HIV阳性率趋势也一致。

检测试剂的灵敏度决定真阳性标本的检出率，而特异性决定真阴性标本的检出率，对于灵敏度和特异性均较高的试剂既可以降低真阳性标本的漏检，又可以避免真阴性标本的误诊。近几年，血清学检测试剂通过改进其灵敏度和特异性不断提高，核酸检测因其高特异性和灵敏度曾被作为血液筛查的金标准。本研究中，血清学筛查单试剂阳性的184例HBV、66例HCV、76例HIV献血者标本再经核酸检测呈阳性反应例数分别为2例、0例、3例。血清学筛查试剂与核酸检测试剂筛查阳性符合率分别为1.09%、0、3.95%。推测可能是因为血清学检测试剂灵敏度高而特异性太低，导致出现大量假阳性标本，经高特异性的核酸检测试剂检测呈阴性结果。提示：应进一步提高血清学检测试剂的特异性，防止出现大量假阳性结果，导致无偿献血者献血资格的淘汰，献血人群的流失。

本研究中，77886例献血者标本经HBV、HCV、HIV血清学筛查呈非反应性者分别为77 658例、77 754例、77 782例，这些血清学检测阴性标本经核酸检测呈反应性样本例数分别为14例、7例、3例。这说明HBV、HCV、HIV三种核酸检测试剂均存在阳性标本漏检情况。如果这些漏检标本被发往临床，必然给输血安全和患者的生命健康带来严重威胁，因此应进一步提高血清学试剂的检测灵敏度，降低弱阳性标本的漏检。同时此结果也说明：通过核酸检测可弥补血清学检测的不足，提高阳性标本的检出率，降低漏检率，进一步提高血液安全。这与其他多项核酸与血清学联合检测相关研究的结果[15-17]一致。

此外，我们的研究结果还显示：HBV、HCV、HIV三种血清学试剂筛查漏检率分别为 0.018%、0.009%、0.004%，具有明显统计学差异。这种差异除了与病毒在献血人群的流行率不同有关外，还与HBV、HCV、HIV三种血清学筛查试剂的灵敏度密切相关。不同的 ELISA 试剂生产厂家包被的抗原、抗体片段以及酶标抗体的浓度均不同，这必然会导致各检测试剂灵敏度的差异。本研究中HCV和HIV的血清学漏检率均低于HBV，推测一方面是因为HCV和HIV在献血人群中的流行率低于HBV，另一方面是因为HCV和HIV血清学筛查试剂均为抗原抗体联合检测，缩短了窗口期，提高了弱阳性标本的检出，而HBV血清学筛查试剂只检测乙肝病毒表面抗原。

通过本研究表明：在无偿献血者标本血清学筛查的基础上，开展核酸检测，可降低窗口期和弱阳性标本的漏检，提高检测准确性和血液质量，降低输血传播病原体的风险。同时，应进一步提高血清学筛查试剂灵敏度和特异性，降低血液标本的漏检率和误诊率。