硝酸银-硅胶分离技术及其在昆虫信息素研究中的应用

张 诺, 陈 立, 谢广林

(1. 长江大学 农学院，湖北 荆州 434025；2. 河北大学 生命科学学院，生命科学与绿色发展研究院，河北 保定 071002)

昆虫通常可释放多组分信息素，而这些信息素的结构往往十分相近[1]，大多是长链不饱和的醇、羧酸、酯、酮或烯烃类化合物，并存在大量的异构体。此外，两种或两种以上近缘种昆虫利用同一种化学物质作为信息素的情况并不罕见。这些昆虫能通过不同信息素成分或主、次要成分间比例的不同，尤其是顺反异构体间比例的差异，来区分彼此。例如：棉铃虫Helicoverpa armigera和烟青虫Heliothis assulta同属于鳞翅目重要害虫，棉铃虫体内的顺-11-十六碳烯醛与顺-9-十六碳烯醛质量比为96:4，而烟青虫体内二者的质量比为4 : 96，棉铃虫和烟青虫可通过含有相反比例的顺-11-十六碳烯醛和顺-9-十六碳烯醛，达到种间生殖隔离的目的[2]。欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis的信息素有两种类型：顺式型由质量比为97% ～ 99%的顺-11-十四碳烯醇乙酸酯及1% ～3%的反-11-十四碳烯醇乙酸酯组成；反式型则由1% ～ 3% 的顺-11-十四碳烯醇乙酸酯及97% ～99%的反-11-十四碳烯醇乙酸酯组成[3-4]。

昆虫信息素在昆虫体内的含量极低，通常利用气相色谱-质谱联用 (GC-MS) 技术进行初步鉴定，然后通过化学合成进行结构验证[5]。昆虫信息素的化学合成常依赖于Wittig 反应，在合成过程中通常会形成顺、反异构体，使产物的分离纯化变得复杂[6]。在昆虫信息素的实际应用中，有时候异构体的存在会对信息素有效成分产生拮抗作用，从而导致信息素生物活性降低甚至完全失效[7-8]，但有时又必须加入适量的异构体才能获得最佳的引诱效果[9]。因此，在昆虫信息素的鉴定、合成及生物活性测试中，顺、反异构体的分离尤为重要。

硝酸银-硅胶分离技术能利用银离子的络合能力有效分离含有双键的异构体，在不饱和酯、醛和碳氢化合物的分离上应用广泛[6]。此外，在昆虫信息素的鉴定和合成过程中，利用硝酸银-硅胶分离技术可以快速高效地分离顺、反异构体[10-12]。目前国内外尚未见硝酸银-硅胶分离技术在昆虫信息素研究方面的相关综述，鉴于此，本文拟对硝酸银-硅胶分离技术的原理、制备方法及影响因素进行详细介绍，总结应用该方法成功分离的昆虫信息素的结构特征，旨在为昆虫信息素的分离、纯化提供参考方法。

1 硝酸银-硅胶分离技术

1.1 原理及特点

20 世纪30 年代末，Lucas 研究组发现银离子与烯烃之间的络合反应是可逆的，并能快速达到平衡[13-14]，其平衡常数的对数值与烯烃的氢化热呈线性关系，即银离子-烯烃配合物的稳定性随烯烃自由能常数的增加而增加[15]。 Scholfield 等[16]在使用逆流分配法分离油酸甲酯和亚麻酸甲酯的过程中发现，利用银离子与双键之间的络合作用在不饱和化合物分离方面存在巨大潜力。从此，硝酸银被掺入到硅胶吸附剂中用于不饱和脂类及醇类化合物的定性、定量分析或制备分离[16-19]。例如，已成功用于分离含不同双键数和几何构型的脂肪酸甲酯和甘油三酯[20-23]。此后，高效液相色谱泵的应用进一步促进了硝酸银-硅胶分离技术的发展，并实现了快速、高效的制备分离[24-26]。

硝酸银可以改变硅胶表面的吸附性能，吸附在硅胶上的银离子与不饱和键之间发生了电子转移，在π 键上形成了银离子配合物，从而改变了分配系数[27]。不含双键或双键数目较少的化合物与硅胶之间的吸附作用较弱，更易被洗脱，进而使饱和度不同的化合物得以分离。化合物与硝酸银-硅胶之间吸附作用的强度与其碳链的长度和碳链上的双键数目有关。在具有一定极性的洗脱剂中，化合物的碳链越短，双键数目越多，吸附作用力越强；反之越弱。根据这种特性，可以将具有不同双键数目和碳链长度的不饱和化合物分离开来。另外，硝酸银-硅胶对顺式异构体的吸附力要强于对反式异构体的吸附力，因而可以将顺、反异构体分开[28]。

1.2 硝酸银-硅胶分离技术与硅胶层析分离技术在昆虫信息素分离中的优缺点比较

硅胶吸附剂具有分离效率高、分辨率高、分析时间短、峰容量高等优点，适用于极性差异很小的多组分混合物的分离[29]。常规硅胶柱层析分离技术是利用物质在硅胶柱上的吸附力差异将不同的物质分离开来，极性弱的物质不易被硅胶吸附而易被洗脱，极性强的物质易被吸附而不易被洗脱。虽然常规硅胶柱层析分离技术操作简单，应用广泛，但是无法将烯烃异构体分开。

昆虫信息素多数由两种以上组分组成，且多含不饱和烃[30]，硝酸银-硅胶分离技术正是利用不饱和化合物与银离子之间络合作用的强弱不同而将物质分离开来，在分离饱和与不饱和的组分、顺式和反式异构体上具有较明显的优势。

1.3 硝酸银-硅胶的制备及其分离效果影响因素

1.3.1 制备方法 根据样品含量称取适量的层析用硅胶，加入到含有硝酸银的水溶液中 (硝酸银质量分数一般为5%～20%) ，水溶液需将硅胶完全浸没，充分搅拌，外包锡箔纸避光静置约2 h，在旋转蒸发仪上减压蒸干，直至外层锡箔纸完全变黑。将所得硝酸银-硅胶转至玻璃器皿中，于120℃烘箱中活化12 ～ 15 h，最后转移到棕色瓶内，于低温干燥处避光保存[31-34]。硝酸银-硅胶层析柱的填充方法与普通硅胶层析柱相同，但硝酸银-硅胶层析柱需避光处理[32]。

1.3.2 分离过程及结果分析 在上样前，先利用硝酸银-硅胶薄层层析探索柱层析的洗脱条件，即利用常规方法在硝酸银-硅胶薄层层析板上点样、展缸中展开、合适的显色剂显色，根据样品成分的比移值 (Rf) 确定洗脱条件。从硝酸银-硅胶层析柱上洗脱下来的组分，再经硝酸银-硅胶薄层层析，根据Rf值确定是否为同一种物质。将含有同一物质的组分合并，通过气相色谱-质谱联用仪、核磁共振、红外光谱和高分辨质谱来确定其结构。

1.3.3 影响硝酸银-硅胶分离效果的因素 采用硝酸银-硅胶分离化合物时，硅胶颗粒的大小、所用溶剂的极性、上样量、Ag+浓度及待分离化合物烯烃的取代程度都是影响分离效果的直接因素。

1.3.3.1 硅胶颗粒的大小 硅胶颗粒直径越小，比表面积越大，所填层析柱的分离效果越好。但如果硅胶颗粒直径过小，层析柱中洗脱剂的流出速度过慢，反而会影响化合物分离的效果[35]。

1.3.3.2 溶剂极性 在一定极性的洗脱剂中，碳链越长，双键数越少，不饱和化合物分子与Ag+的吸附作用就越弱，就越容易被洗脱；反之则不易被洗脱。与Ag+吸附作用较弱的物质可以用极性较弱的洗脱剂洗脱，但与Ag+吸附作用较强的物质则需要用极性较强的洗脱剂洗脱[36]。

1.3.3.3 上样量 与常规硅胶柱层析分离技术一样，上样量的多少也会影响硝酸银-硅胶分离技术的分离效果。硝酸银-硅胶柱分离实际上是一种制备型液相色谱。这种制备色谱区别于分析型色谱的一个重要特点就是上样量往往是适当过载的，即在非线性的条件下进行制备性分离。但当色谱柱严重过载时，色谱柱的柱效会呈指数下降，导致失去分离能力[36]。

1.3.3.4 烯烃的取代模式 硝酸银-硅胶分离法特别适用于分离取代模式不同的烯烃，烯烃的取代模式决定了其在硝酸银-硅胶柱上的洗脱顺序。不饱和烯烃与硝酸银-硅胶柱里面Ag+结合能力的顺序为：RCH=CH2>R2C=CH2>R2C=CHR>R2C=CR2[37]，即双键上的取代度越高，其结合能力越弱，可被优先洗脱；而取代度越低的烯烃，结合能力越强，后被洗脱下来，从而达到将取代模式不同的烯烃化合物分离的目的。

1.3.3.5 Ag+浓度 通过化合物的络合能力来确定能达到最佳分离效果的Ag+的浓度。双键的数量决定了化合物与Ag+的络合能力，双键数越多，络合能力越强。通过比较不同浓度的Ag+(15、50、100 和150 mmol/L) 分别对(Z,E) -7-十二碳烯乙酸酯、(Z,E) -7-十六碳烯乙酸酯、(Z,E) -11-十六碳烯乙酸酯、(Z,E) -7-十二碳烯醇、(Z,E) -8-十二碳烯醇、(Z,E) -9-十二碳烯醇、(Z,E) -11-十四碳烯醇、法尼醇及法尼烯的分离效果发现，使用100 mmol/L的硝酸银可以最大程度地分离单不饱和几何异构体和位置异构体，使用50 mmol/L 的硝酸银可以最好地分离双不饱和异构体，15 mmol/L 硝酸银对多不饱和化合物的选择性最高[38]。比较质量分数不同 (3%、5%、7%及10%) 的硝酸银的分离效果发现，5%硝酸银-硅胶柱可以完全分离3,13-十八碳二烯-1-醇乙酸酯的4 个异构体[11]。

2 硝酸银-硅胶分离技术在昆虫信息素研究中的应用

2.1 不饱和脂肪醇、醛和酯类性信息素

昆虫性信息素中，含羟基、醛基和酯基的分子结构较多，如鳞翅目昆虫的性信息素主要为含有10～18 个碳的直链烷烃的醇、醛或酯[39]，多用硝酸银-硅胶分离技术分离在合成过程中产生的顺、反异构体 (表1) 。

马尾松毛虫Dendrolimus punctatus性信息素为5,7-十二碳二烯醇乙酸酯，有4 个异构体，分别为(Z,Z)-5,7-十二碳二烯醇乙酸酯、(Z,E)-5,7-十二碳二烯醇乙酸酯、(E,Z)-5,7-十二碳二烯醇乙酸酯和(E,E)-5,7-十二碳二烯醇乙酸酯。郑如玉等[40]利用TLC (20%硝酸银-硅胶G 薄层板) 为高效液相色谱(HPLC)中的硝酸银-硅胶柱找到较好的流动相—V(二氯甲烷) :V(己烷)=1 : 1 或1 : 2 (体积分数为90% ～ 95%) 和体积分数为5%～10% 的乙醚，该流动相可完全分离这4 种顺、反异构体。通过Wittig 反应可以合成马尾松毛虫性信息素的前体化合物—(Z,E)-5,7-十二碳二烯-1-醇，利用硝酸银-硅胶柱层析可将目标产物—(Z,E)-5,7-十二碳二烯-1-醇与其异构体—(E,E)-5,7-十二碳二烯-1-醇分离[41-43]。

小蔗螟Diatraea saccharalis信息素腺体含有十六醛、(Z)-十六碳-11-烯醛和9,11-十六碳二烯醛的4 种几何异构体，在合成(Z,Z)和(Z,E)-9,11-十六碳二烯醛时，使用硝酸银-硅胶分离中间体，再经重铬酸吡啶氧化得到纯的性信息素成分[44]。

以戊二醇和己二醇为起始原料合成梨小食心虫Grapholitha molesta性信息素——(Z)-8-十二碳烯醇乙酸酯，所得顺、反异构体用硝酸银-硅胶薄层层析或层析柱进行分离，可得顺(Z)-8-十二碳烯醇乙酸酯及其反式异构体[9]；以癸二醇为起始原料合成欧洲玉米螟性信息素——顺-11-十四碳烯醇乙酸酯和反-11-十四碳烯醇乙酸酯，终产物用含18%硝酸银的硅胶柱层析分离，可得纯度达98%的顺-11-十四碳烯醇乙酸酯和纯度达99%的反-11-十四碳烯醇乙酸酯[45]；棉红铃虫Pectinophora gossypiella的性信息素为10-丙基-反-5,9-十三碳烯醇乙酸酯[46]，用四亚甲基-l,4-双三苯基溴化磷与4-庚酮和5-乙酰氧基戊醛反应得到顺-和反-10-正丙基-反-5,9-十三碳二烯基乙酸酯，顺、反异构体混合物经硝酸银-硅胶柱层析分离，用V(正己烷) :V(乙醚)=97 : 3 的溶剂为洗脱剂，得到反式异构体[47]；在合成棉褐带卷叶蛾Adoxophyes orana性信息素时，采用硝酸银-硅胶柱对产物进行分离，可以得到纯度高达99%的(Z)-9-十四碳烯醇乙酸酯和(Z)-11-十四碳烯醇乙酸酯[48]；以1,8-辛二醇为原料合成苹果小卷蛾Laspeyresia pomonella性信息素成分(Z)-9-十四碳烯醇乙酸酯，所得产物中顺式异构体纯度达98%，采用硝酸银-硅胶薄层层析 (展开剂为V(石油醚) :V(乙酸乙酯)=85 :15) 分离，可得(Z)-9-十四碳烯醇乙酸酯[49]；在合成黄地老虎Agrotis segetum性信息素顺-5-十碳烯-1-醇乙酸酯时，用硝酸银-硅胶柱分离，目标异构体的纯度高达99%[50]。

2.2 不饱和直链烃性信息素

昆虫性信息素成分中有许多不饱和烃。Doi 等[51]为了鉴定嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae的性信息素成分，对果蝇表皮的碳氢化合物进行了分析和生物测定，经硅胶和硝酸银-硅胶层析分离得到(Z,Z)-5,25-三十一碳二烯和(Z,Z)-4,26-三十一碳二烯，发现这两种碳氢化合物都能诱导雄性求偶行为；松树蜂Sirex noctilo雌虫角质层上的化合物可以诱导同种雄虫的交配行为，用正己烷浸提雌虫角质层，浸提液经硝酸银-硅胶分离其中的饱和烃和不饱和烃，通过质谱鉴定出引起雄虫交配反应的性信息素组分为(Z)-7-二十七烯、(Z)-7-二十九烯和(Z)-9-二十九烯[52]。

2.3 萜烯类性信息素和跟踪信息素

红带袖蝶Heliconius melpomene雄虫在交配过程中会将抑性欲素 (anti-aphrodisiac pheromone) 转移到雌虫身上，导致雌虫对其他雄虫产生排斥反应，这种信息素主要由(E)-β-ocimene ((E)-2,6-二甲基-2,5,7-三烯辛烷) 和一些微量成分组成[53]。为确认(E)-β-ocimene 的结构，Schulz 等[53]按照Matsushita 等[54]的方法制备了质量比为7 : 3 的(Z)- 和(E)-ocimene 混合物，后用硝酸银-硅胶分离技术将(E)-ocimene 的纯度提高。未交配的桃仁蜂Eurytoma amygdali雌虫对雄虫有强烈的吸引力，Krokos 等[55]在探索雌虫分泌性信息素的具体部位时，采用硝酸银-硅胶分离技术分离其表皮化合物，其中烷烃首先被洗脱下来，其次是烯烃，最后是二烯烃，经实验室生物测定后发现，雌虫分泌的(Z,Z)-6,9-二十三碳二烯和(Z,Z)-6,9-二十五碳二烯及少量烯烃对雄虫具有吸引效果 (表1) 。

Vander Meer 等[56]对红火蚁Solenopsis invicta的跟踪信息素进行了鉴定，发现含有(Z,E)-α-法尼烯、(E,E)-α-法尼烯、(Z,E)-α-高法尼烯和(E,E)-α-高法尼烯4 种构型，之后其在合成红火蚁跟踪信息素的过程中，使用含10% 硝酸银的硅胶柱层析，可将高法尼烯的顺、反异构体成分完全分离[57]。Williams 等[58-59]在对蚂蚁杜氏腺分泌物进行鉴定的过程中，证实Z,Z,Z-异法尼烯是红火蚁跟踪信息素的有效成分，对其进行合成，产生了8 种异构体，其中E,E,E-异法尼烯、Z,E,E-异法尼烯、E,E,Z-异法尼烯和Z,E,Z-异法尼烯这4 种异构体较稳定，可用气相色谱法直接分离，而不稳定的Z,Z,Z-异法尼烯、E,Z,Z-异法尼烯、Z,Z,E-异法尼烯和E,Z,E-异法尼烯则需在含有20% 硝酸银的RSil 柱上分离。以甲基环丙基酮和6-甲基-5-烯-2 酮为原料，经Wittig 反应得到红火蚁的跟踪信息素成分(Z,E)-α-法尼烯及其异构体(Z,Z)-α-法尼烯，在合成的最后阶段，利用含20% 硝酸银-硅胶的中压色谱可将这两种法尼烯异构体分离[60](表1) 。

2.4 聚集信息素

硝酸银-硅胶分离技术在聚集信息素的研究中也多有应用 (表1) 。雄性阔角谷盗Gnatocerus cornutus可产生微量的聚集信息素，将350 万头雄虫的挥发物加到5%的硝酸银-硅胶柱上，然后进行气相色谱分析，发现主要信息素成分为菖蒲二烯(acoradiene)[61]。(Z)-5,13-十四烯基乙酸酯为木蠹蛾Chilecomadia valdiviana幼虫的聚集信息素，以十二烷-1-醇为起始原料，在经Wittig 反应的合成过程中产生质量比为94 : 6 的顺、反异构体混合物，经硝酸银-硅胶柱层析分离纯化[62]。(S,Z)-十二碳-3-烯-11-内酯为锈赤扁谷盗Cryptolestes ferrugineus的聚集信息素，以6-溴-1-己醇为起始原料，经Wittig 反应构建了关键的顺式双键，然后通过光延反应合成(S,Z)-十二碳-3-烯-11-内酯，所得粗产物经常规硅胶柱层析纯化后，再用硝酸银-硅胶柱层析对顺式和反式异构体进行分离[63]。

表1 利用硝酸银-硅胶分离技术分离的昆虫信息素Table 1 The insect pheromones separated by silver nitrate-silica gel separation technique

3 讨论与展望

昆虫信息素具有无毒、无害和种属特异性等特点，利用昆虫信息素可进行高效、无污染、可持续的害虫治理[64]。昆虫信息素一般含量极低，可采用有机溶剂浸泡法、冷凝法、动态顶空吸附法、固相微萃取法等方法提取[65]，但要实现用昆虫信息素防治害虫的目的，还需依赖化学合成。一般来说，昆虫信息素的碳链较长，且多为不饱和的醇、醛、酯，有时含多个双键，在全合成过程中，大部分中间体可使用常规硅胶柱层析来分离纯化，但是终产物多为顺、反异构体的混合物；此外，昆虫信息素的合成大多依赖于Wittig反应，易产生不同比例的顺、反异构体混合物，因此，顺、反异构体的分离纯化在昆虫信息素的研究中就显得尤为重要[6]。对于结构较为复杂的昆虫信息素成分，如药材甲Stegobium panicem性信息素 ((2S,3R,1R)-2,3,5-三甲基-6-(1-甲基-2-氧代丁基)-4-氧代-氧杂-5-环己烯)[66]、日本丽金龟Popillia japonica性信息素 ((R,Z)-5-(1-十碳烯基)二氢-2-(3H)呋喃酮)[67]等，在对其鉴定及合成的过程中，可以尝试使用硝酸银-硅胶柱层析法进行分离纯化。

总体来说，硝酸银-硅胶分离技术主要应用于昆虫信息素顺、反异构体的分离，能够相对快速地分离含双键的昆虫信息素组分，在昆虫信息素的研究中扮演重要角色。随着科学研究的不断深入，与其他分析技术相结合，和先进的科学仪器联用，硝酸银-硅胶分离技术必将在昆虫信息素结构与功能等方面得到更广泛的应用，对害虫可持续控制技术也将发挥重要支撑作用，更好地推动昆虫学科的发展。