五种琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂与灰葡萄孢琥珀酸脱氢酶的结合模式及抗性机制分析

陶丽红, 李佳俊, 夏美荣, 李 康, 范黎明,苏发武, 吴文伟, 王凯博*,, 叶 敏*,

(1. 云南农业大学 云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650201；2. 云南省农业科学院 农业环境资源研究所，昆明 650201)

琥珀酸脱氢酶抑制剂 (succinate dehydrogenase inhibitor, SDHI) 类杀菌剂是杀菌剂抗性行动委员会 (FRAC) 2009 年划分出来的一类作用机制和抗性机理相似的化合物[1]。该类杀菌剂通过抑制病原菌线粒体呼吸作用过程三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶 (succinate dehydrogenase, SDH)来阻碍能量代谢、抑制病原菌生长并导致其死亡，最终达到防治病害的目的[2]。现已成功开发的SDHI 类杀菌剂从化学结构上可分为11 类、包括23 个品种，主要用于防治大田作物、果蔬、花卉等的灰霉、赤霉、菌核、叶斑等多种病害[3]。例如：啶酰菌胺(boscalid) 是目前使用范围最广、用量最大的SDHI 品种，主要防治由子囊菌和半知菌引起的灰霉、白粉、菌核等病害[4]；噻呋酰胺 (thifluzamide)具有良好的内吸传导性，主要用于防治由担子菌引起的病害，特别是对由立枯丝核菌Rhizoctonia solani引起的水稻纹枯病具有显著的防治效果[5]。但由于SDHI 类杀菌剂作用靶点单一，其抗性问题日益凸显，甚至出现了多重抗性[6-8]。据报道，瓜果产区灰葡萄孢Botrytis cinerea对啶酰菌胺和吡噻菌胺 (penthiopyrad) 的抗性频率高达90%以上[9-10]。目前，FRAC 将该类杀菌剂划归为中等至高抗性风险。

目前对SDHI 类杀菌剂抗性问题的研究主要从分子生物学层面出发。基因测序表明，灰葡萄孢对啶酰菌胺、异丙噻菌胺 (isofetamid)、氟吡菌酰胺 (fluopyram)、氟唑菌酰胺 (fluxapyroxad)和吡噻菌胺产生抗性是由于其琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白亚基 (Ip, sdhB) B-H272Y、B-H272R、B-H272L、B-P225F、B-P225L、B-P225T和B-N230I 等位基因发生了点突变[7,9-12]，西瓜蔓枯病菌Didymella bryoniae对啶酰菌胺和氟吡菌酰胺产生抗性，也是由于B-H272R和B-H272Y 基因发生了突变[6]；而小麦赤霉病的病原菌禾谷镰刀菌Fusarium graminearum对氟唑菌酰羟胺 (pydiflumetofen) 产生抗性，则是由于细胞色素结合蛋白亚基 (sdhC) C-R86H、CR86C 和C-A83V 发生了基因突变[13]。然而，现有研究多采用分子生物学手段分析菌株的SDH 抗药性突变位点，对SDHI 与SDH 结合模式研究的较少。杀菌剂与靶标蛋白的亲和力、及结合特异性很大程度上能够反映靶标生物对药剂的敏感性[14]，研究杀菌剂与作用靶标之间的结合模式，不仅能揭示杀菌剂的杀菌原理、抗性产生的机理，而且能够指导高效杀菌剂新颖结构的合理设计及改造，从而减少杀菌剂的使用、确保作物高产优质、减少环境污染[15-18]。

随着计算机科学的发展，使用同源建模预测未知蛋白质结构的技术越来越成熟，分子对接在药物与靶标蛋白结合模式研究中也被广泛应用[19-20]。同类蛋白结构之间普遍具有一定同源性，氨基酸序列同源度大于30%即可使用同源建模方法获取未知蛋白的三维结构[21]。虽然目前植物病原真菌SDH 的三维结构尚未被鉴定，但鸟的SDH 与萎锈灵 (carboxin) 的复合晶体结构2FBW、鸟的SDH与草酰乙酸的复合晶体结构1YQ3 以及猪心SDH与苯甲酰胺的复合晶体结构4YTP 都已被测定，且琥珀酸脱氢酶黄素蛋白 (Fp，sdhA) 和sdhB 在不同物种间高度保守[22]。因此，可通过同源建模的方法构建植物病原菌的SDH 结构。

本研究拟以灰葡萄孢为模式病原微生物，通过同源建模方法构建其SDH 的三维模型，并通过分子对接分析SDHI 类杀菌剂与BcSDH 的结合模式。同时根据已报道的氨基酸残基突变位点构建BcSDH 突变模型，并分析BcSDH 突变前后与SDHI类杀菌剂的亲和力及结合模式的变化，探究氨基酸残基突变引起的SDHI 类杀菌剂抗药性产生的机制以及SDHI 类杀菌剂之间的交互抗性机制，另外，对已报道的突变最多的sdhB 进行保守性预测，分析其突变类型。旨在为研究灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂抗药性机制提供理论支撑，并为新结构SDHI 类杀菌剂分子的合理设计提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 计算机软件及在线工具

1.1.1 软件 分子对接软件：AutoDock Vina-1.1.2。

突变体构建软件：UCSF Chimera-1.11.2。

图形操作化软件：PyMol-2.1.0 Open-Source。

1.1.2 网站和工具 蛋白序列数据库：NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

蛋白结构数据库：RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)。

同源建模工具：SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)。

模型评价工具：SAVES v6.0 (https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/)。

结合模式分析工具：PLIP (https://projects.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip)。

保守性分析工具：MEME (https://meme-suite.org/meme/)。

1.2 试验方法

1.2.1 同源建模与模型评价 从NCBI 网站获取灰葡萄孢的SDH 蛋白序列信息，选定同株菌的4 个亚基分别为sdhA (GenBank: ALJ75671.1)、sdhB (GenBank: ALK82288.1)、sdhC (GenBank:ALJ75678.1)和sdhD (GenBank: ALJ75685.1)，用BLAST 工具检索同源度最高、模型最合理的蛋白。在RCSB PDB 蛋白结构数据库检索并下载最优蛋白的3D 模型，将4 个亚基氨基酸序列作为一个整体，以最优蛋白模型为模板，用SWISS 在线建模工具同源构建BcSDH 的3D 模型。然后将建好的模型在线提交SAVES 服务器，利用PROCHECK工具对所建模型进行评价，评价结果以Ramachandran Plot 展现，根据最优区域、合理区域、可接受区域和不合理区域的百分比评价所建模型的合理性[23]。

1.2.2 杀菌剂与蛋白结合的活性口袋分析 根据已知的2 F B W 蛋白晶体结构中配体萎锈灵(carboxin, SDHI 类杀菌剂) 周围5 Å (1 Å = 0.1 nm)内的氨基酸残基B-P169、B-S170、B-W172、BW173、B-H216、B-I218、C-I27、C-W32、CM36、C-S39、C-I40、C-R43、D-D57 和D-Y58 的活性口袋初步推测BcSDH 的活性口袋由B-P225、B-S226、B-W228、B-W229、B-H272、B-I274、C-L72、C-P77、C-W81、C-S84、C-G85、C-R88、D-D143 和D-Y144 氨基酸残基构成，结合最优蛋白模型使用AutoDockTools 工具调校分子对接参数[24]，得到活性口袋的位置和参数分别为center_x = 14.576，center_y = 16.048，center_z = 8.299；size_x = 1 6.862，size_y = 14.419，size_z = 16.357；exhaustiveness = 8， num_modes = 9，energy_range = 3。

1.2.3 分子对接及结合模式分析 分子对接在HP－PC 上运行，处理器为Intel Core i5－1035G1 CPU 3.6GHz。对接步骤为：先构建化合物库，在PubChem 下载异丙噻菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、吡噻菌胺和啶酰菌胺这5 种SDHI 类杀菌剂的三维结构，保存为sdf 格式，然后采用Open Babel 工具转换为pdbqt 格式[25]。使用AutoDock-Tools 软件对同源构建的BcSDH 蛋白进行去水、加氢、删除不合理的杂原子及能量最小化等结构优化，根据1.2.2 节中优化的对接参数将SDHI 类杀菌剂与同源构建的BcSDH 进行对接[26]，保留9 个对接构象，根据对接亲和力打分排序，生成最优配体受体复合物。再将复合物上传至PLIP 网站分析杀菌剂与BcSDH 之间的结合模式[27]，使用PyMol软件进行可视化处理。

根据文献报道的突变位点[7,9-12]，利用UCSF Chimera 工具[28]将灰葡萄孢sdhB 的B-H272 (组氨酸，His，H) 分别突变为亮氨酸 (Leu，L)、精氨酸(Arg，R) 和酪氨酸 (Tyr，Y)，将B-P225 (脯氨酸，Pro，P) 分别突变为苯丙氨酸 (Phe，F)、亮氨酸和苏氨酸 (Thr，T)；构建B-H272L、BH272R、B-H272Y、B-P225F、B-P225L 及BP225T 突变体，依旧使用1.2.2 节的对接参数和1.2.3 节的方法进行分子对接和结合模式分析，比较靶标突变前后受体与配体之间的亲和力及结合模式变化。

1.2.4 基因序列保守性分析 在NCBI 中使用BLAST 工具查询BcSDH 易发生突变的sdhB 相关同源蛋白，得到100 条与灰葡萄孢sdhB 同源的蛋白氨基酸序列，将这100 条sdhB 氨基酸序列对齐后上传至MEME[29]在线工具进行保守性分析，获得Motif 图。

2 结果与分析

2.1 同源建模构建的BcSDH 模型及评价

灰葡萄孢琥珀酸脱氢酶BcSDH 与2FBW 蛋白序列比对结果如图1 所示，sdhA 和sdhB 高度保守，与2FBW 的同源度分别为72.39 %和72.22 %；两种嵌膜蛋白sdhC 和sdhD 与2FBW 的同源度分别达37.60 % 和30.30 %，4 个亚基蛋白序列与2FBW 的整体同源度为64.54 %，符合建模标准。对构建的3D 蛋白模型进行PROCHECK 评价结果如图2 Ramachandran Plot 所示，共有1 063 个N-Gly和N-Pro 氨基酸残基参与建模，其中：826 个分布在最优区域，占总数的90.17 %；83 个分布在合理区，占总数的9.06 %；6 个分布在可接受区域；占总数的0.66 %；1 个分布在不合理区域，占总数的0.11 %。总体99.89 %氨基酸在蛋白晶体结构中的位置符合要求，说明同源构建的BcSDH 蛋白3D 结构模型合理，同时符合立体化学phi、psi二面角分布，具有良好的稳定性和立体化学性。

如图3 所示，将同源构建的BcSDH 与模板蛋白2FBW 进行叠合，二者的均方根差RMSD 值为0.099，说明所建模型与模板蛋白在结构水平上具有很高的相似度。

2.2 SDHI 与BcSDH 的结合模式分析

5 种杀菌剂与BcSDH 分子对接后选择最优构象周围5 Å以内的氨基酸，确定活性口袋由B、C、D 亚基共同构成 (表1)，参与形成口袋的氨基酸分别为sdhB 的P225、S226、W228、W229、R270、H272、I274，sdhC 的L72、W81、I82、S84、G85、L86、N87、R88、I89、C92、H153 和sdhD 的R98、G136、S139、C140、D143、Y144。参与形成疏水作用的氨基酸分别为sdhB的P225、W229、H272、I274 和sdhC 的L72、W81、I82、L86、R88、I89；参与形成氢键的氨基酸为sdhB 的W229，sdhC 的W81、N87、R88和sdhD 的Y144；参与形成卤键的氨基酸分别为sdhC 的G85 和sdhD 的D143；参与形成π-π 堆积作用的氨基酸为 sdhC 的W81；参与形成π-阳离子相互作用的氨基酸为sdhC 的R88。初步推断这些相互作用力能够将杀菌剂牢固地结合在BcSDH蛋白大分子中，在发挥药效方面起着至关重要的作用。sdhB 的S226、W228、R270，sdhC 的S84、C92 和sdhD 的R98、G136、S139、C140 虽然在活性口袋内，却不参与形成相互作用力，表明这些氨基酸可能对杀菌剂发挥药效的贡献不大。值得注意的是，文献报道的BcSDH 抗性突变位点有P225、N230 和H272[7,9,11]，由分子对接和结合模式分析可知，P225 和H272 在活性口袋内参与形成相互作用力，这两个氨基酸发生突变可能对杀菌剂与BcSDH 蛋白大分子的亲和力和结合模式造成影响；而N230 既不在活性口袋内，也不参与形成相互作用力，推测该氨基酸发生突变与否对亲和力和结合模式影响不大，该氨基酸突变可能不直接影响灰葡萄孢对SDHI 类杀菌剂的敏感性。

表1 SDHI 类杀菌剂与BcSDH 分子对接及结合模式分析Table 1 Molecular docking and binding modes analysis of SDHI fungicides with BcSDH

2.3 主要抗性突变位点分析

由表2 数据看出，异丙噻菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、吡噻菌胺和啶酰菌胺与野生型BcSDH 的亲和力分别为 −30.514、−37.620、−35.112、−31.350和 −33.440 kJ/mol。整体而言，靶标突变对氟吡菌酰胺和吡噻菌胺与BcSDH 的亲和力影响最大，对异丙噻菌胺的影响次之，对氟唑菌酰胺和啶酰菌胺的影响最小。P225F 和H272R 突变后，5 种杀菌剂与BcSDH 的亲和力明显下降；P225L 突变，造成异丙噻菌胺、氟吡菌酰胺和吡噻菌胺3 种杀菌剂与靶标蛋白的亲和力下降；P225T、H272L 和H272Y 突变，只造成少数几种杀菌剂与靶标蛋白的亲和力下降；也有个别杀菌剂与靶标蛋白的亲和力未下降反而略微上升。综上所述：P225F 和H272R突变可能是灰葡萄孢对SDHI 类杀菌剂产生抗性的主要突变类型；P225L 突变可能与灰葡萄孢对部分SDHI 类杀菌剂的抗性相关；P225T、H272L 和H272Y 突变可能不是灰葡萄孢对SDHI类杀菌剂产生抗药性的主要原因。因此，需进一步研究P225F、P225L和H272R 氨基酸残基突变后杀菌剂与靶标蛋白的结合模式，才能进行初步的抗性机制分析。

表2 杀菌剂与野生型和突变型的BcSDH 的对接亲和力Table 2 Binding affinity between SDHI fungicides and wild-type or mutant-type BcSDH

2.4 BcSDH 突变的抗性机制分析

2.4.1 5 种杀菌剂与野生型和突变型BcSDH 的结合模式 由图4 可以看出：BcSDH 的B-P225F、B-P225L 和B-H272R 氨基酸残基突变后，异丙噻菌胺与突变型BcSDH 的结合模式和形成相互作用力的氨基酸均发生了变化。B-P225F 突变后，异丙噻菌胺不能进入活性口袋，形成的疏水作用、氢键、π-π 堆积作用和π-阳离子相互作用明显减少，亲和力下降 (表2)，不与B-H272、B-I274、C-L72、C-I82、C-L86 和C-R88 形成氢键、疏水作用和π-阳离子相互作用，反而与B-F225 和DY 1 4 4 形成了疏水作用和π-π 堆积作用。BP225L 突变后，异丙噻菌胺胺部分裸露在活性腔外，不参与形成作用力，与酸部分形成相互作用力的氨基酸也发生了变化，能与B-L225 和DY144 形成疏水作用，不与C-L72、C-I82 和CL86 形成疏水作用。B-H272R 突变后，异丙噻菌胺胺部分构象变化较大，与灰葡萄孢sdhC 形成的相互作用力减少，异丙噻菌胺的噻吩环仍能与BL272 和B-I274形成疏水作用。

氟吡菌酰胺与野生型和突变型BcSDH 的结合模式如图5 所示：氟吡菌酰胺的酰胺键主要与野生型BcSDH 形成氢键，氨基侧吡啶环主要与P225和H272 形成疏水作用。B-P225F、B-P225L 和B-H272R 突变。在很大程度上改变了氟吡菌酰胺与靶标蛋白的结合模式，氟吡菌酰胺未能或只有部分进入活性腔，羰基侧苯环主要参与疏水作用的形成，氨基侧吡啶环则主要参与形成π-π 堆积作用或π-阳离子相互作用。B-P225F 突变后，氟吡菌酰胺与该突变蛋白的氨基酸残基形成的相互作用力也发生了很大变化，酰胺键不再与CR88 形成氢键，吡啶环不再与B-P225 形成疏水作用；P225L 突变后氟吡菌酰胺苯环和吡啶环旋转得基本与酰胺键平行，整个分子几乎在一个平面上，形成的氢键和疏水作用也在减少；H272R 突变后氟吡菌酰胺酸和胺部分形成的相互作用力刚好与野生型BcSDH 的相反，酸部分主要参与形成疏水作用，胺部分吡啶环横在活性腔口，与B-W229和D-Y144 能够形成氢键。

由图6 可以看出，氟唑菌酰胺的酰胺键也主要是与野生型BcSDH 形成氢键、联苯环主要参与形成疏水作用、酸和胺末端的氟主要参与形成卤键。B-P225F 突变很大程度上改变了氟唑菌酰胺与靶标蛋白的结合模式及构象，使结合位点整体向外移，吡唑环上的-CF3旋转得与酰胺键平行，只有联苯环参与形成极少的疏水作用，表明BP225F 氨基酸残基突变存在极高的抗药性风险。B-P225L 突变几乎不改变氟唑菌酰胺与突变型BcSDH 的结合模式，除了D-D143 不再形成卤键外，形成相互作用的氨基酸反而增多了，能够与B-L225 形成疏水作用、与B-S226 形成卤键。BH272R 突变使吡唑环略微发生了旋转，羰基O 不再与C-W81 形成氢键、吡唑环氟不与D-D143 形成卤键，联苯环与B-P225 形成疏水作用。

吡噻菌胺与BcSDH 的结合模式如图7 所示：与前3 种杀菌剂的结合模式相似，酰胺键也主要是参与形成氢键，杂环和碳链主要参与形成疏水作用，吡咯环末端氟参与形成卤键。P225F 氨基酸残基突变后，吡噻菌胺构象发生了折叠，使之卡在活性腔外，只有末端碳链与B-F225 和DY144 形成疏水作用。P225L 突变使得吡噻菌胺的噻吩环垂直于酰胺键，酰胺键、吡咯环、噻吩环和碳链均参与形成相互作用力，只是与之形成作用力的氨基酸残基发生了一定变化。H272R 突变对吡噻菌胺的构象影响不大，但与C-W81 形成的疏水作用减少，不与B-I274、C-I89 形成疏水作用，这很可能降低吡噻菌胺在作用靶标中的稳定性。

啶酰菌胺与野生型和突变型BcSDH 的结合模式如图8 所示，B-P225F 突变使啶酰菌胺在活性腔外构象发生了翻转，导致结合位点和形成作用力的氨基酸残基发生了改变，吡啶环能与C-W81形成氢键、与B-F225 形成π-π 堆积作用。B-P225L突变使啶酰菌胺位置略微发生了偏移，能够与BL225 形成疏水作用、与C-R88 形成π-阳离子相互作用。B-H272R 突变使羧酸部分发生了旋转，吡啶环与酰胺键几乎在一个平面上，参与形成相互作用力的氨基酸残基和形成的作用力都增加了，能与B-P225、B-W228、B-R272、B-I274 形成疏水作用，与C-R88 形成π-阳离子相互作用，与BW229、C-W81 形成π-π 堆积作用，只是键长大于5 Å；不再与C-I89、D-Y144 形成疏水作用和氢键，推测B-H272R 突变对啶酰菌胺与靶标蛋白的结合模式影响极大。

2.4.2BcSDH 突变的抗性机制分析 5 种杀菌剂在BcSDH 活性口袋的位置和构象如图9 所示：以酰胺键为中心，杀菌剂的酸部分能够插入野生型BcSDH 活性腔底、胺部分在活性腔口。B-P225F突变后，活性腔口变窄，杀菌剂酸部分不能进入活性腔，异丙噻菌胺则整个横在腔口；B-P225L突变后，氟唑菌酰胺和啶酰菌胺仍能进入活性腔，亮氨酸突变为脯氨酸对这两种杀菌剂与靶标蛋白的结合模式影响不大，但使异丙噻菌胺、氟吡菌酰胺和吡噻菌胺与靶标蛋白的结合模式发生了改变；B-H272R 突变后，精氨酸侧链所占空间比组氨酸稍大，使得活性腔底变窄，进而使其与靶标蛋白的结合模式发生变化。因此，B-P225F 和B-H272R 突变在很大程度上改变着杀菌剂与靶标蛋白的结合模式，这两个点突变可能是引起BcSDH对5 种杀菌剂产生抗性的主要原因，也可能是引起SDHI 类杀菌剂之间交互抗性的原因之一；BP225L 突变可能降低BcSDH 对异丙噻菌胺、氟吡菌酰胺和吡噻菌胺的敏感性，但该突变可能不是引起BcSDH 对SDHI 类杀菌剂产生抗性的主要原因，也不是引起SDHI 类杀菌剂之间交互抗性的主要原因。

2.5 灰葡萄孢sdhB 的保守性分析

由MEME 工具分析得到Motif 图 (图10)，通过对比与灰葡萄孢sdhB 同源的100 条氨基酸序列，发现B-P225、B-S226、B-W228、B-W229、B-R270、B-H272 和B-I274 均位于保守区域。但本研究分子对接和结合模式分析表明：B-P225F、B-P225L 和B-H272R 氨基酸残基突变会引起BcSDH 与SDHI 类杀菌剂的亲和力下降、结合模式发生改变，说明保守序列并非不发生突变序列，在自然选择压下这种突变可能是随机发生的，B-P225F、B-P225L 和B-H272R 氨基酸残基突变可能为随机突变。

3 讨论

计算机模拟分子对接能快速准确地瞄准药物与靶标间的相互作用[20,30]。本研究表明，SDHI 类杀菌剂与BcSDH 通过形成疏水作用、氢键、卤键、π-π 堆积作用和π-阳离子相互作用而发挥药效，所形成的化学键键长较短，一般为2～4 Å。其中酰胺键是SDHI 类杀菌剂的灵魂部分，大部分疏水作用和氢键的形成都有酰胺键的参与；羧酸和胺部分的咪唑、吡唑、吡啶等杂环也起着至关重要的作用，能够与BcSDH 氨基酸残基形成牢固的氢键、π-π 堆积作用、π-阳离子相互作用；苯环、联苯环和碳链则大部分参与疏水作用、π-π 堆积作用和π-阳离子相互作用的形成；氟、氯等卤素一般是参与形成卤键来增加亲脂性。对该类杀菌剂进行结构修饰与改造时酰胺键不可替代，胺部分可引入苯环、联苯环、杂环或碳链来增加稳定性，酸部分则可引入杂环、卤素及其他活性基团来增加亲脂性[31]。SDHI 类杀菌剂与BcSDH 通过形成上述几种分子间的相互作用力，使得配体与受体间形成稳固的连接，这与Zhu 等[32]的报道一致，但不同的研究者报道的参与形成作用力的氨基酸各有差异。本研究通过结合模式分析显示，氟吡菌酰胺和氟唑菌酰胺能够与B-W229、BH272、B-P225、B-I274、C-L72、C-W81 和C-R88形成疏水作用，与C-W81、C-N87、C-R88 和DY144 形成氢键，与C-G85 和D-143 形成卤键，与Gao[14]报道的氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺能与BW229、D-Y143 形成氢键，与C-W80 形成π-π 堆积作用，与B-R270 形成卤键略有差异。

对比野生型和突变型BcSDH 与5 种SDHI 的结合模式可知，B-P225F 和B-H272R 氨基酸残基突变能够引起异丙噻菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、吡噻菌胺和啶酰菌胺与靶标蛋白的亲和力下降，结合模式发生改变，形成相互作用力的氨基酸发生极大变化，这两个点突变可能是引起SDHI类杀菌剂之间交互抗性的原因之一。Hu 等[9]的研究也表明，B-P225F 突变会造成灰葡萄孢对氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、吡噻菌胺和啶酰菌胺产生抗性。本课题组前期从田间采集的灰霉菌株中分离到了具有抗啶酰菌胺的B-P225F 突变的灰葡萄孢 (数据未发表)；而2012 年Avenot 等[6]研究表明，西瓜蔓枯病菌Didymella bryoniaeB-H272Y、B-H272R 氨基酸残基突变对啶酰菌胺具有非常高的抗性，对吡噻菌胺具有高度抗性，却对氟吡菌酰胺敏感，可能是由于氟吡菌酰胺当时刚被登记不久 (2009 年被登记)，并未得到广泛应用，且不同病原微生物对SDHI 类杀菌剂的交互抗性机制可能存在差异。另外，本文预测的B-P225L 突变会造成异丙噻菌胺、氟吡菌酰胺和吡噻菌胺与靶标蛋白的亲和力下降，可能降低BcSDH 对这3 种杀菌剂的敏感性，这与Lalève 等[33]报道的B-P225L突变会影响灰葡萄孢对SDHI 类杀菌剂的敏感性的研究结果一致。

本研究是基于分子对接手段，通过分析灰葡萄孢sdhB 氨基酸残基突变前后与5 种SDHI 类杀菌剂的亲和力及结合模式的变化，来阐释灰葡萄孢对SDHI 类杀菌剂抗药性产生的机制和SDHI 类杀菌剂之间的交互抗性机制。Autodock vina 软件的打分函数只能粗略的评估结合能，对接打分的高低与配体和受体之间相互作用力多少可能不一致。如，异丙噻菌胺与BcSDH 的亲和力 (−30.514 kJ/mol)较氟吡菌酰胺与BcSDH 的亲和力 (−37.620 kJ/mol)弱，但异丙噻菌胺与BcSDH 形成的相互作用力却比氟吡菌酰胺与BcSDH 形成的相互作用力多 (图4、图5)，且本文只对已报道的sdhB 上可能与灰葡萄孢抗SDHI 类杀菌剂相关的突变位点进行了研究，未来可进一步对构成活性口袋的sdhC 和sdhD突变位点[34,35]进行研究，还可通过分子动力学模拟、随机突变位点预测等方法[36-37]，进一步分析灰葡萄孢对SDHI 类杀菌剂的抗性。然而，同源建模和分子对接方法仅是计算机模拟方法，无法100%模拟杀菌剂与蛋白之间最真实的结合方式。在今后研究中，可以使用冷冻电镜或X-ray 衍射法解析BcSDH 与SDHI 类杀菌剂的复合晶体结构，精确地分析两者之间的结合模式。此外，植物病原菌对杀菌剂产生抗性可能是靶标基因的点突变；也可能是在杀菌剂胁迫下的应激反应调控，通过RNA 干扰来抑制相关基因的表达，从而获得暂时的、可逆的抗药性[38]；还可能由于碱基替换导致了氨基酸多态性而影响酶的内在敏感性和生物适应度[39]；或是外排转运蛋白基因的过表达、解毒作用、单核苷酸多态性 (SNPs) 等多种途径单一或共同调控的结果[40]。本研究仅从靶标蛋白氨基酸残基突变角度通过计算机模拟阐述了灰葡萄孢对SDHI 类杀菌剂抗性产生的机制，未来可进一步探索这些非靶点抗性在灰葡萄孢中发挥作用的效力和程度，将有助于更全面地剖析灰葡萄孢抗药性产生的机制，进而更高效合理地指导该类病害的管理和抗药性风险治理。

4 结论

本文通过同源建模构建了BcSDH 三维结构模型，并根据已报道的氨基酸残基突变位点构建了BcSDH 的突变体模型，使用分子对接的方法分析了异丙噻菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、吡噻菌胺和啶酰菌胺5 种SDHI 类杀菌剂与野生型和突变型BcSDH 的结合模式，并使用MEME 工具预测保守性。结论如下：

1) 5 种杀菌剂与BcSDH 具有较强的亲和力，酸部分能够插入BcSDH 活性腔底、胺部分在活性腔口，杀菌剂能够与BcSDH 形成牢固的疏水作用、氢键、卤键、π-π 堆积和π-阳离子等相互作用。

2) B-P225F 和B-H272R 氨基酸残基突变可能是引起BcSDH 对5 种杀菌剂产生抗性的主要原因，也可能是引起SDHI 类杀菌剂之间交互抗性的原因之一；B-P225L 氨基酸残基突变可能降低BcSDH 对部分杀菌剂的敏感性，但可能不是引起BcSDH 对SDHI 类杀菌剂产生抗性的主要原因。

3) 灰葡萄孢的B-P225 和B-H272 位于sdhB的保守区域，B-P225F、B-H272R 和B-P225L 氨基酸残基突变可能为随机突变。

本研究是基于结构生物学，通过计算机模拟初步阐释了BcSDH 对SDHI 类杀菌剂产生抗药性的机制及SDHI 类杀菌剂之间产生交互抗性的机制，能够为今后继续研究灰葡萄孢对SDHI 类杀菌剂的抗药性机制提供理论支撑，并为SDHI 类杀菌剂结构的合理设计、修饰与改造提供参考，避免产生交互抗性。