吡唑醚菌酯在柑橘汁加工过程中的残留动态

董 超, 赵其阳, 李 晶, 左 巍, 李志霞, 焦必宁

(西南大学 柑桔研究所, 重庆400712)

柑橘疮痂病和柑橘炭疽病是柑橘生产过程中的两种常见真菌性病害，严重影响柑橘产量和品质[1-2]。吡唑醚菌酯(图式1)作为一种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂[3]，兼具杀菌和治疗作用[4]，被广泛应用于柑橘中这两种病害的防治，但已有报道称其对于非靶标生物表现出高毒性[5-6]。对于柑橘中农药残留的风险评估，往往主要关注农药在田间的残留消解。如龙小方[7]的研究结果表明，吡唑醚菌酯在柑橘中的消解规律符合一级反应动力学方程，半衰期为9.24～10.27 d；最终残留试验结果表明，柑橘全果(0.31 mg/kg)及果皮(1.45 mg/kg)中吡唑醚菌酯的最大残留量远高于果肉(0.024 mg/kg)中的最大残留量。随着柑橘产业现代化的发展，柑橘逐渐被应用于精深加工，衍生出多种加工产品。如NFC (not from concentrate) 果汁、柑橘皮精油等[8-10]，柑橘皮精油在食品加工中主要用作赋香剂，可使食品具有独特的柑橘风味，同时也具有一定的药用价值，对多种病菌具有很强的抑制作用[11]。另外，一些副产物，如柑橘皮渣，主要由柑橘皮(约占60%～65%)、种子及丝穰组成[12]，可用于饲料产业及有机肥料产业[12-13]，从柑橘皮中提取的多种功能性成分(如辛弗林，橙皮苷)可用于医疗产业[14-15]。

目前，关于柑橘加工过程中农药残留的研究报道较少。李云成等[8]研究了炔螨特在柑橘汁加工过程中的残留行为，结果发现，炔螨特在柑橘皮精油中的残留量显著高于在其余加工产品中的残留量。康霞丽等[16]研究了氟啶胺及阿维菌素在柑橘汁加工中的残留量变化，结果发现，两种农药均在柑橘皮精油中富集，而在其余柑橘加工产品中的残留量均有所下降，且榨汁是降低残留最有效的方法。Cámara 等[17]在实验室条件下模拟了几种农药在橙汁商业化生产过程中的残留行为，结果表明，几种农药的残留量在榨汁过程中均显著降低。但尚未见吡唑醚菌酯在柑橘汁加工过程中残留动态的报道。鉴于此，本研究利用HPLCMS/MS 建立了吡唑醚菌酯在柑橘加工产品及清洗液中残留量的分析方法，并在重庆市江津区和湖南省洪江市两地以普通甜橙为研究对象进行田间施药，然后按照商业化柑橘汁加工工艺进行加工并测定其残留量，以期明确吡唑醚菌酯在柑橘汁商业化加工过程中的残留动态，为吡唑醚菌酯在柑橘加工食品中的安全性评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290-6495 高效液相色谱-串联质谱仪(HPLC-MS/MS，美国Agilent 公司)；Sigma3-15K 台式冷冻离心机(德国Sigma 公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；有机相针式过滤器(0.22 μm，上海安谱科学仪器有限公司)。

吡唑醚菌酯(pyraclostrobin) 标准品(纯度>99%，上海安谱科学仪器有限公司)；甲醇和乙腈(色谱纯，美国Sigma Aldrich 公司)；N-丙基乙二胺(PSA)，无水硫酸镁、乙酸和氯化钠(分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司)。

1.2 田间试验

田间试验按照《加工农产品中农药残留试验准则》[18]，于2019 年分别在湖南省洪江市和重庆江津区两个柑橘产区进行。供试作物为普通甜橙Citrus sinensis(L.) Osbeck。供试药剂为40%吡唑 • 咪鲜胺水乳剂，施药剂量为5 倍最高推荐剂量(最高推荐剂量为有效成分33.3 mg/kg，田间施药剂量为有效成分166.7 mg/kg)，以提高吡唑醚菌酯在甜橙中的残留量。于甜橙成熟采摘前41 d 开始进行喷雾施药，共施药3 次，施药间隔期为10 d。于末次施药后21 d 进行采样，每个试验点选取约100 棵甜橙树，将树上无病虫害的果实全部采收，取果量大于1.5 t，果实采收后立即加工。

1.3 果汁加工试验

果汁加工试验分别于2019 年12 月10 日(湖南试验点)和2019 年12 月15 日(重庆试验点)在国家柑桔工程技术研究中心中试车间进行。加工工艺流程与橙汁商业化加工相同[16]，加工流程及取样点见图1。共设置9 个取样点，包含原料果(全果、果肉)、清洗果(全果、果肉) 、初榨汁、精滤汁、NFC 果汁、浓缩汁、皮渣、油水混合物和皮精油9 种基质样品。

清洗与分级：先将洗果池和喷淋水池装满自来水，然后预浸泡果实，开启鼓泡机进行清洗，保持流水不断进入清洗池(多余的水从溢流口自动排出)，清洗5 min 后打开提升机并喷淋自来水。清洗后对果实进行大小分级，以便于榨汁，提高出汁率。

榨汁：采用JBT 全果榨汁机进行榨汁，得到初榨汁，并在皮渣出口处随机采集柑橘皮渣。

精滤：采用螺旋榨汁机完成。螺旋轴与机座之间形成可以调整大小的出渣口，可通过控制对物料的压力大小来调节出汁率。

杀菌：精滤果汁经过真空脱气后于100 ℃下杀菌30 s，然后迅速冷却至37 ℃左右，得到NFC果汁。

浓缩：采用三效四体降膜蒸发器对果汁进行浓缩，浓缩一效温度(即进料温度)为107 ℃，三效温度(即出料温度)为50～60 ℃，浓缩橙汁最终可溶性固形物含量为质量分数65%。

皮精油提取：在榨汁过程中用喷淋水对榨汁机进行喷淋，得到油水混合物，先用转速为7 402 r/min 的碟式分离机对油-水混合物进行粗分离，然后用转速为6 300 r/min 的离心机进行精分离，得到柑橘皮精油。

每种加工产品采集3 个平行样品，每份样品约300 g，于 −18 ℃保存。于2020 年1 月4 日进行并完成样品前处理步骤，并在前处理完成后24 h内完成上机检测。根据《植物源性农产品中农药残留储藏稳定性试验准则》[19]，试验样品在30 d内完成检测，可不进行储藏稳定性试验，因此本研究未开展储藏稳定性试验。

1.4 残留分析方法

1.4.1 仪器分析条件

色谱条件： Agilent ecipse plus C18色谱柱(2.1 mm × 50 mm，1.8 μm)；流速0.3 mL/min；进样量2 μL；柱温40 ℃；流动相A 相为体积分数0.1% 的甲酸水溶液，B 相为甲醇；梯度洗脱程序： 0～2 min，90%→10% A；>2～5 min，10% A；>5～5.1 min，10%→90% A；>5.1～6 min，90% A。

质谱条件：正离子电喷雾离子源(ESI+)，多反应监测模式(MRM)；干燥气温度250 °C；氮气压力206.8 kPa；喷嘴电压500 V；ifunnel 高200 V，低100 V；鞘气温度375 °C；鞘气流速12 L/min；毛细管电压4 000 V；干燥气流速14 L/min；质谱分析参数见表1。

表1 吡唑醚菌酯的质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters of pyraclostrobin

1.4.2 样品提取与净化 准确称取5.0 g 柑橘加工样品及清洗液样品(精油样品为2.5 g，提取前加入2.5 mL 水)于50 mL 离心管中，加入10 mL 提取剂(乙腈，含体积分数1%乙酸)，超声提取15 min 后，加入0.5 g NaCl 及2.0 g 无水MgSO4涡旋1 min，于10 000 r/min 下离心5 min；取2 mL 上清液至装有50 mg PSA 的4 mL 离心管中，涡旋1 min，于3 000 r/min 下离心5 min；取上清液，经0.22 μm有机相针式过滤器过滤，即为空白基质提取液，待测。

1.4.3 标准溶液配制及标准曲线的绘制 准确称取吡唑醚菌酯标准品20.0 mg 于20.0 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 000.0 mg/L 的标准储备液，于 –20 ℃避光保存。用乙腈将标准储备液稀释成质量浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.5、2.5、5、10 mg/L 标准工作溶液，备用。

以空白基质提取液稀释标准工作溶液，配制成质量浓度分别为0.002 5、0.005、0.01、0.05、0.25 和0.5 mg/L 匹配标准工作溶液(精油基质匹配标准工作溶液的质量浓度分别为0.005、0.01、0.05、0.25、0.5 和1 mg/L)，以质量浓度为横坐标(x)，对应的峰面积为纵坐标(y)，绘制基质匹配标准曲线。

1.4.4 添加回收试验 向空白基质样品中添加0.01、0.1 和2 mg/kg (精油基质：0.2、2 和20 mg/kg)3 个水平的吡唑醚菌酯标准工作溶液，每个水平重复5 次，于室温下静置0.5 h 后按照1.4.2 节的方法进行前处理，获得样品提取液后按照1.4.1 节的条件测定。测定前，将添加水平为2 mg/kg 的样品提取液按V(空白基质提取液) :V(样品提取液)=3 : 1 进行稀释，添加水平为20 mg/kg 的样品提取液按V(空白基质提取液) :V(样品提取液)=19 : 1 进行稀释，其余添加水平的样品不再进行稀释。计算添加回收率和相对标准偏差。

1.5 加工因子计算

按《加工农产品中农药残留试验准则》方法[18]进行。加工因子(PF)用于评估柑橘汁加工过程对吡唑醚菌酯残留的影响，当PF 大于1 时表明吡唑醚菌酯在该加工过程中残留量升高，反之则表明残留量降低。

2 结果与讨论

2.1 检测方法验证

由表2 可知：在本研究的线性范围内，吡唑醚菌酯的基质匹配标准曲线线性关系良好，相关系数(r)为0.990 5～0.999 9。

表2 吡唑醚菌酯在柑橘加工产品和清洗液中的线性关系Table 2 The linear relation of pyraclostrobin in citrus processing products and cleaning fluid

添加回收试验结果(表3) 表明：在0.01、0.1 和2 mg/kg (皮精油基质为0.2、2 和20 mg/kg)3 个添加水平下，吡唑醚菌酯在柑橘加工产品及清洗液中的回收率为63%～110%，相对标准偏差(RSD)为1.3%～9.6%。以最低添加水平为方法定量限(LOQ)，则吡唑醚菌酯在精油基质中的LOQ为0.2 mg/kg，在其余基质中的LOQ 为0.01 mg/kg。

表3 吡唑醚菌酯在柑橘加工产品和清洗液中的添加回收率及相对标准偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of pyraclostrobin in citrus processing products and cleaning fluid (n=5)

以上结果表明该方法符合农药残留检测的要求[20]，适用于不同柑橘加工产品及加工设备清洗液中吡唑醚菌酯残留的检测。

2.2 吡唑醚菌酯在柑橘加工产品中的残留

2.2.1 试验可行性验证 为避免加工设备中的农药残留影响试验结果的准确性，对加工设备进行清洗，并采集各个采样点的清洗液进行检测。结果表明：清洗液中不含有吡唑醚菌酯残留。此外，在柑橘加工当日采集3 份未清洗的全果样品进行检测，根据《加工农产品中农药残留试验准则》要求[18]，原料果中目标农药的残留量要大于10 倍LOQ 或者0.1 mg/kg。结果发现，重庆和湖南两个试验点的原料果中吡唑醚菌酯的残留量均大于10 倍LOQ 和0.1 mg/kg (表4)，满足开展加工残留试验的要求。

表4 吡唑醚菌酯在柑橘加工产品中的残留量及加工因子Table 4 Residues and processing factors of pyraclostrobin in processed citrus products

2.2.2 吡唑醚菌酯在柑橘全果及果肉中的残留

将原料果分别制成全果和果肉样品，比较发现，柑橘果肉中吡唑醚菌酯的残留量低于全果中残留量的10%，表明吡唑醚菌酯主要残留于果皮中。经清洗后，湖南和重庆两试验点柑橘全果中吡唑醚菌酯的残留量分别减少了28%和39%，而果肉中吡唑醚菌酯的残留量变化较小，可能是因为清洗过程可部分去除柑橘果皮表面的农药残留，而难以去除果肉中的农药残留[21]。清洗过程对于农药残留的去除作用可能受清洗时间、清洗液的性质(pH 等)、农药的理化性质[辛醇/水分配系数(Kow)、溶解度及蒸气压]等因素影响[22-24]。邢峰等[24]研究了4 种农药在莼菜加工流程中的残留行为，结果发现，莼菜中的农药残留量随着清洗时间的延长而逐渐降低，并在一定时间后相对稳定。pH 值的改变往往影响农药的水解，进而在一定程度上影响农药的残留量，如二嗪磷在低和高pH 值条件下都会迅速水解，因为碱和酸均可催化其发生水解作用[25]。Chai 等[26]比较了不同溶剂的洗涤效果，结果发现，用体积分数10%醋酸水溶液清洗可有效去除黄瓜和草莓中的农药残留，且农药的溶解度和蒸气压越高，越容易在清洗过程中被去除。Guardia-Rubio 等[27]研究了多种农药在橄榄上的残留行为，结果发现，Kow 较低的农药易经过清洗过程去除，如清洗过程对西玛津(Kow 值为200) 的去除效果显著好于对敌草隆(Kow 值为741)。一般而言，农药的Kow 值越高越容易进入农产品表面的蜡质层，在清洗过程中不易被去除[13]。吡唑醚菌酯的Kow 值较高，属于脂溶性农药，本研究中使用自来水清洗5 min 仅可去除部分农药残留。而使用清洗剂则可能会导致清洗剂在加工产品中的残留且可能会影响加工产品的品质[28]。橙汁商业化加工中的清洗时间一般也为5 min 左右，延长清洗时间会降低生产效率并增大成本，而缩短清洗时间可能会增大农药残留风险，因此在后续的研究中可以综合考察不同清洗时间的影响，从而为加工工艺的进一步优化提供参考。

2.2.3 吡唑醚菌酯在4 种柑橘果汁中的残留 由表4 可知，初榨汁中吡唑醚菌酯的残留量接近或低于0.01 mg/kg，低于原料果中残留量的2%，可见榨汁过程可有效降低吡唑醚菌酯残留，可能是由于吡唑醚菌酯在皮渣、果肉和果汁中的分配性质具有差异，其残留容易分布在皮渣和果肉中，而较难转移到果汁中[29]。

初榨汁经精滤得到精滤汁，精滤汁经杀菌过程得到NFC 果汁。本研究中，精滤汁及NFC果汁中吡唑醚菌酯的残留量均低于LOQ (0.01 mg/kg)，虽然残留风险较小，但难以判断精滤及杀菌过程对于吡唑醚菌酯残留量的影响。

湖南试验点的浓缩汁中吡唑醚菌酯残留量显著高于精滤汁中的残留量，可能是因为浓缩过程中水分的蒸发，而且吡唑醚菌酯的热稳定性较高，在浓缩过程中不易挥发和降解。本研究中，虽然浓缩汁中吡唑醚菌酯的残留量有所升高，但也远低于原料果中的残留量，而且浓缩汁一般用于市售果汁的生产，在生产过程中还会进行稀释，从而使吡唑醚菌酯残留量进一步下降[16]。

2.2.4 吡唑醚菌酯在柑橘皮渣中的残留 湖南和重庆2 个试验点柑橘皮渣中吡唑醚菌酯的残留量均高于原料果中的残留量(表4)，产生了富集效应，因此在综合利用皮渣时应重视农药残留风险。毛雪飞[30]研究了清洗、干燥和发酵3 种方式对皮渣中农药残留的去除作用，结果表明，超声清洗、微波干燥以及发酵均可有效去除农药残留。

2.2.5 吡唑醚菌酯在柑橘皮精油中的残留 本研究中，吡唑醚菌酯在柑橘皮精油中的残留量显著高于原料果中的残留量(表4)，可能是因为柑橘皮精油富含的活性成分d-苧烯(d-limonene)具有良好的溶解性，使农药易穿过果皮表层而残留于果皮组织中，从而导致皮精油中农药残留量显著增加[31]。Li 等[21]的研究发现，脂溶性农药易在精油中富集。吡唑醚菌酯是一种脂溶性农药，在精油中易于富集，因此应重视其残留风险，在加工前可通过监测原料果中的残留量，在加工后可以通过蒸馏、吸附等途径降低其残留。

2.3 柑橘加工产品中吡唑醚菌酯的加工因子最佳评估值

参考Li 等[32]的方法，采用加工因子的最佳评估值(best estimate)整体评价柑橘汁加工过程对于吡唑醚菌酯残留的影响。根据《农药残留加工因子手册》[33]，加工因子的最佳评估值可采用其最大值、平均值或者中值。本试验基于2 个试验点的PF 数据，采用平均值作为其最佳评估值。结果(表4)发现：吡唑醚菌酯在柑橘皮精油和果渣中的PF 最佳评估值均大于1，表明吡唑醚菌酯在柑橘皮精油和果渣中易于富集；而在其余加工产品中的PF 最佳评估值均小于1，尤其在初榨汁中的PF 最佳评估值为<0.02，表明其余加工过程均可降低吡唑醚菌酯的残留量，且榨汁是降低吡唑醚菌酯残留的高效途径。

3 结论

柑橘榨汁过程是降低吡唑醚菌酯残留的高效途径，初榨汁中吡唑醚菌酯残留量低于其在原料果中残留量的2%。吡唑醚菌酯易在果渣(PF 的最佳评估值为1.2) 和精油(PF 的最佳评估值为15.6)中富集，在后续利用过程中应考虑其农药残留风险。