杀虫双在李子中的残留行为及长期膳食摄入风险评估

李春勇, 金 静, 王 霞, 秦 曙

(山西农业大学，山西功能农产品检验检测中心，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(太原)，太原 030031)

杀虫双(thiosultap-disodium)是一种沙蚕毒素类神经毒剂，对潜叶蛾和风蝶等害虫有强烈的触杀和胃毒作用，内吸作用强，能被作物的叶、根等吸收和传导，具有高效、低毒、低残留等特点[1]，适用于防治水稻、蔬菜、果树、棉花和小麦等作物上的多种虫害[2]。杀虫双与目前已有的杀虫剂无交互抗性，且对非靶标作物和环境安全。杀虫双虽已在大豆、甘蔗、果树、蔬菜等作物上登记[3-4]，但尚未制定其在李子上的最大残留限量(MRL)值[5]，也未见其在李子上的残留行为报道。

杀虫双在酸性条件下稳定，但在碱性条件下易降解为沙蚕毒素，如图式1 所示。

目前，关于杀虫双的提取转化、检测方法有诸多报道。林涛等[6]建立了热带水果中杀虫双的超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)检测方法，盘杨桂等[7]探索了甘蔗中杀虫双的气相色谱(GC-FPD、GC-ECD) 的分析方法，朱慧敏等[8]采用气相色谱法测定了叶菜类蔬菜上的杀虫双残留量，但目前尚未见杀虫双在李子上的残留分析方法。以上直接由液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定杀虫双含量或用气相色谱方法测定由杀虫双转化的沙蚕毒素含量的方法，普遍存在定量限高(LC-MS/MS 4.0 μg/kg) 、前处理过程有毒试剂用量大、转化时间长、提取溶剂残留干扰仪器测定等问题；另外，针对李子基质含糖量较高容易出现乳化现象，本研究通过对前处理方法进行优化，建立了一种将杀虫双快速转化为沙蚕毒素，并结合高效液相色谱-串联质谱 (HPLC-MS/MS) 检测李子中沙蚕毒素含量，进而确定杀虫双残留量的方法；并以GB 2763—2019 规定的杀虫双残留物定义沙蚕毒素的含量推荐最大残留限量(MRL)值，对全国6 地的杀虫双残留量 (检测去除果核后的整个果实，但残留量计算包括果核) 进行长期膳食暴露风险概率计算，以期为保障农产品安全、制定杀虫双在李子上的残留限量标准提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

I-Class XEVO TQ-S Micro 液相色谱-质谱联用仪，美国Waters 公司；GM300 刀式研磨仪，德国莱驰公司；5804 R、5824 R 离心机，Eppendorf Germany；LP2500 多管涡旋混合仪，莱普特科学仪器公司；XK80-A 快速混匀器，江苏新康医疗器械有限公司；QUINTIX224-1CN、BS210S 和CAP8201 天平，赛多利斯科学仪器 (北京) 有限公司。

杀虫双 (thiosultap-disodium) 标准品 (纯度99.0%) ，Dr. Ehrenstorfer 公司；沙蚕毒素草酸盐(nereistoxin oxalate) 标准品 (纯度99.0%) ，Dr.Ehrenstorfer 公司；质量分数为18%的杀虫双水剂，安徽华星化工有限公司；正己烷和乙腈 (色谱纯) ，TEDIA®；甲醇 (色谱纯) ，MERCK LiChrosolv®；甲酸 (色谱纯) ，Fisher chemical Optima®；其他试剂均为国产分析纯。试验用水为蒸馏水。

1.2 田间试验

按照《农药残留试验准则》[9]和《农药登记残留田间试验标准操作规程》[10]设置试验小区，每小区2 棵李子树，重复3 次，小区间设保护带，另设清水对照小区。供试药剂为18%杀虫双水剂。

1.2.1 消解动态试验 试验分别在山西省晋中市榆次区东阳镇和北京市大兴区长子营镇两地进行。按有效成分540 mg/kg (1.5 倍推荐剂量) 于李子生长至成熟个体一半大小时施药，分别于施药后2 h 及1、3、5、7、10、14、21、30 和45 d 采用随机取样法采样：在李子树的不同方向及上、中、下、里、外等不同部位采集24 个以上 (不少于2 kg) 生长正常、无病害的李子果实，去核后切成1 cm 左右的碎块，混匀，四分法缩分留样，用刀式研磨仪匀浆后取200 g，于 −18 ℃贮存，备用。

1.2.2 最终残留试验 试验分别在山西省、北京市、吉林省、河南省、山东省和贵州省6 地进行，按360 mg/kg (推荐剂量) 和540 mg/kg (1.5 倍推荐剂量) 施药2～3 次，分别于施药后10、15 和20 d 采集样品，另设清水空白对照，采样及样品预处理方法同消解动态试验。

1.3 样品提取与净化

称取李子样品5.0 g 于50 mL 离心管中，加入10 mL 含质量分数1%的L-半胱氨酸盐酸盐的0.1 mol/L 盐酸溶液，于2 500 r/min 下涡旋振荡30 min；加入5 mL 浓氨水及2 mL 质量分数为2%的氯化镍水溶液后继续涡旋30 min；加入10 mL正己烷，涡旋5 min，于8 000 r/min 下离心5 min；取上清液2.0 mL，于40 ℃恒温水浴氮气吹干，用甲醇定容至2 mL，经0.22 μm 滤膜过滤，待测。

1.4 检测条件

色谱条件：Waters Atiantis dC18色谱柱 (100 mm× 2.1 mm，5 μm) ；柱温30 ℃；进样量2 μL；流动相A 为0.1% 甲酸水溶液，流动相B 为甲醇，梯度洗脱程序见表1，流速0.2 mL/min，在此条件下沙蚕毒素的保留时间为1.19 min。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition

质谱条件：电喷雾离子源 (ESI+) ，多反应监测 (MRM) 扫描模式；毛细管电压3.3 kV；锥孔电压30 V；离子源温度150 ℃；去溶剂气和锥孔反吹气均为高纯氮气，去溶剂气温度400 ℃；去溶剂气流速650 L/h，锥孔反吹气流速50 L/h；碰撞气为高纯氩气，沙蚕毒素定量离子对150 > 105.0，碰撞能14 eV；定性离子对150 > 61.2，碰撞能18 eV。

1.5 标准溶液配制及标准曲线绘制

沙蚕毒素标准溶液及基质匹配标准溶液的配制：准确称取0.016 g (精确至0.000 1 g) 沙蚕毒素草酸盐标准品，用乙腈溶解并配制成质量浓度为1 000 mg/L 的沙蚕毒素标准储备液，于 −18 ℃密封保存。用乙腈稀释沙蚕毒素标准储备液，依次配制成100、10、1 mg/L 的标准溶液，再用李子空白提取液稀释，配制成质量浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.1、0.2、0.5 mg/L 的基质匹配标准液。

杀虫双标准溶液的配制：准确称取0.01 g (精确至0.000 1 g) 杀虫双标准品，用乙腈溶解，配制成质量浓度为1 000 mg/L 的杀虫双标准储备液，再用乙腈逐步稀释，向5.0 g 李子空白样品中添加不同浓度杀虫双标准溶液，添加水平分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 和10.0 mg/kg，经1.3 节样品提取与净化，按1.4 节仪器条件检测由杀虫双转化后的沙蚕毒素含量，由杀虫双的添加量与沙蚕毒素的峰面积绘制标准曲线，求出样品中杀虫双的残留量，按公式 (1)～(3) 计算各个添加量杀虫双向沙蚕毒素的转化率。

式中：α1为杀虫双向沙蚕毒素的理论转化率，%；M1为沙蚕毒素摩尔质量，g/mol；M2为杀虫双摩尔质量，g/mol；α2为杀虫双向沙蚕毒素的实际转化率，%；с为杀虫双添加量，g/kg；R为杀虫双添加量对应的残留值，g/kg；α为杀虫双向沙蚕毒素的转化率。

1.6 添加回收试验

在空白李子样品中添加杀虫双标准溶液，添加水平分别为0.01、0.1 和5 mg/kg，按1.3 节的方法提取、净化，按1.4 节的条件检测，计算添加回收率和相对标准偏差。

1.7 长期膳食摄入风险评估

长期膳食摄入风险参数按公式(4) 和 (5) 计算[11-12]：

式中，NEDI 为国家估算每日摄入量，mg/kg bw；STMRi为农药在各类初级食用农产品中的规范残留试验中值，mg/kg；STMR-Pi为加工因子校正后的规范残留试验中值，mg/kg；Fi为一般人群对该食品的消费量，kg；bw 为人体重，kg，中国人群平均体重按63kg 计；RQ 为风险概率，%；ADI 为农药的每日允许摄入量，mg/kg bw。根据《食品中农药残留风险评估指南》[13]计算NEDI值，膳食数据以各类登记作物总的膳食摄入量计算，无法查阅到残留中值的依据风险最大化原则使用MRL 值。RQ≤1 时，可认为残留量对一般人群健康的影响在可接受范围内，比值越小，风险越低，并在膳食风险评估的基础上推荐合适的MRL 值[14]。

2 结果与分析

2.1 方法有效性评价

本研究中样品经含有L-半胱氨酸盐酸盐的盐酸提取，浓氨水-氯化镍转化，正己烷萃取后，采用高效液相色谱-串联质谱 (HPLC-MS/MS) 检测，方法简便高效、稳定性好。由表2 可知，在李子中不同浓度的杀虫双向沙蚕毒素的转化率不同，随着添加浓度的增加其转化率呈下降趋势，因此按照1.5 节绘制标准曲线进行定量更加准确。在0.050～10mg/kg 范围内，沙蚕毒素峰面积 (y) 与杀虫双含量 (x) 间呈幂函数相关：y= 752 635x0.7451，R2= 0.992。沙蚕毒素定量限为0.01mg/kg。

表2 杀虫双向沙蚕毒素的转化率Table 2 The conversion rate of thiosultap-disodium to nereistoxin

在0.01、0.1 和5 mg/kg 3 个添加水平下，杀虫双在李子中的平均回收率在77%～100%之间，RSD在6%～18%之间，符合农药残留检测要求[15]。

2.2 消解动态试验

消解动态试验结果(表3) 表明，杀虫双在李子上的消解规律符合一级反应动力学模型。从结果看，杀虫双在山西、北京李子中消解较快，半衰期分别为3.3 和4.8 d，整个试验过程中，杀虫双在李子中的残留量呈递减趋势。

表3 杀虫双在李子中的消解动态 (2019 年)Table 3 Dissipation of thiosultap-disodium in plum (2019)

2.3 最终残留量试验

最终残留试验结果 (表4) 表明：采收间隔期为10 d 时，杀虫双在李子中的残留量在0.011～0.93 mg/kg 之间，规范残留试验中值 (STMR) 为0.042 mg/kg，最高残留量 (HR) 为0.93 mg/kg；采收间隔期为15 d 时，杀虫双在李子中的残留量在<0.010～1.4 mg/kg 之间，STMR 为0.020 mg/kg，HR 为1.4 mg/kg；采收间隔期为20 d 时，杀虫双在李子中的残留量在<0.010～0.61 mg/kg 之间，STMR 为0.018 mg/kg，HR 为0.61 mg/kg。可见，杀虫双在李子中的STMR 随采样间隔期的延长而降低，与消解动态规律一致。

表4 杀虫双在李子中的最终残留量Table 4 The terminal residues of thiosultap-disodium in plum

2.4 李子中杀虫双在长期膳食摄入风险中所占份额

长期膳食摄入风险评估是依据中国居民营养与健康状况监测调查数据[16]，结合规范残留试验中值或最大残留限量计算国家估算每日摄入量。由于杀虫双仅在中国登记使用，对其急性毒性和风险的理解与评价意义可能远大于长期膳食暴露，因此本研究主要对比不同计算模型下李子中杀虫双在长期膳食摄入风险中所占份额，其中李子采用的是在临界良好农业生产规范 (cGAP) 条件下杀虫双在李子中的残留试验中值，按有效成分360 mg/kg 施药3 次，距最后一次施药10 d 时的STMR 值为0.025 mg/kg，其他登记作物的残留中值来源于 “《食品安全国家标准 农药最大残留限量标准》制定文本” 的编制说明部分。由评估结果(表5) 表明，由STMR、HR 和MRL 值计算的膳食摄入量分别为0.17、0.70 和0.80 mg，李子中杀虫双对应所占的风险份额分别为0.89%、4.93%和0.76%。

表5 李子中杀虫双在长期膳食风险中所占份额Table 5 Share of thiosultap-disodium in plums in long-term dietary risk

3 结论与讨论

根据2019 年在山西、北京、吉林、河南、山东和2020 年贵州6 地进行的田间试验结果表明，18%杀虫双水剂按有效成分360、540 mg/kg 剂量施药2～3 次，于末次施药20 d 后采样，李子中杀虫双残留量在 <0.010～0.61 mg/kg 之间。使用18%杀虫双水剂防治果树害虫时，建议按有效成分540 mg/kg (最高制剂用药量333 倍液) 最多施药3 次，安全采收间隔期15 d。

沙蚕毒素类农药有多种，本研究只讨论杀虫双的残留。杀虫双难以气化，不能用气相色谱直接测定，通过优化前处理方法：样品经含质量分数1%的L-半胱氨酸盐酸盐的0.1 mol/L 盐酸高速涡旋提取，有效解决了乳化问题，经浓氨水-氯化镍转化，利用HPLC-MS/MS 直接检测由杀虫双转化的沙蚕毒素。由表2 可知，在李子中不同浓度的杀虫双向沙蚕毒素的转化率不同，且随浓度的增加呈下降的趋势，为准确定量，本研究采用由杀虫双的添加量与沙蚕毒素的峰面积做的标准曲线来计算样品中杀虫双的残留量。方法简便快速、稳定性好、灵敏度高，减少了有机溶剂的用量，可为杀虫双在其他作物中的残留检测提供参考。

目前，中国尚未制定杀虫双在李子中的MRL值，根据杀虫双在中国登记批准的良好农业规范(GAP) 数据和规范残留试验，按照《农产品及食品中农药残留风险评估应用指南》[13]和《农产品及食品中农药最大残留限量制定指南》[14]，结合18%杀虫双水剂所推荐的安全采收间隔期 (15 d) 的HR 值0.58 mg/kg (以沙蚕毒素计) ，建议杀虫双(以沙蚕毒素计) 在李子上的MRL 值暂定为2 mg/kg。基于临界良好农业生产规范条件下得到的残留试验中值，对中国登记作物上使用的杀虫双在长期膳食摄入风险中所占份额进行计算，据表5 可知，由STMR 计算的膳食摄入量为0.17 mg，而由HR 或MRL 值计算的摄入量为0.70/0.80 mg，已超过杀虫双日允许摄入量 (0.63 mg) 。综观李子中杀虫双在膳食摄入中所占份额：STMR (0.89%) ，HR (4.93%) ，MRL (0.76%) ，可见，利用HR 或MRL 进行李子中杀虫双膳食摄入量计算将大幅度增加不确定度，因此在进行膳食风险评估过程中应谨慎使用HR 或MRL 值代替STMR 值。目前，粮农组织/世界卫生组织农药残留联合专家会议(JMPR) 、欧盟和国际食品法典委员会 (CAC) 等均没有杀虫双的急性参考剂量 (ARfD) 值，因此，不断完善相应数据，对精确评估膳食摄入风险及推荐合理的MRL 值具有科学和现实意义。