高效液相色谱法测定婴幼儿鞋橡胶部件中两种亚硝基胺*

王丽华，林东翔，张玉洁，李 燕，陆婷婷，周 蓉

(南京市产品质量监督检验院，江苏 南京 210028)

N-亚硝基胺化合物是具有-N-N=O官能团物质的总称，是一类很强的化学致癌物质，在已发现的300多种N-亚硝基胺化合物中，约有90%能使40种受试动物发生肿瘤。N-亚硝基胺可通过呼吸道、消化道以及皮肤的吸收进入体内从而诱发癌变。大量的动物试验表明，它们在人体内可能会将DNA烷基化，最终诱发癌症，其致癌性已经被公认。橡胶制品中的N-亚硝基胺主要来自以仲胺为基础的硫化促进剂和硫磺给予体分解后给出仲胺，然后与空气中或配合剂中的氮氧化物(NOx)在酸性条件下生成稳定的N-亚硝基胺[1]。在特定的环境下，橡胶制品中的N-亚硝基胺被释放出来，从而有可能对人体造成巨大的危害。婴幼儿鞋是指鞋号不大于170 mm，3周岁以下婴幼儿穿用的鞋，婴幼儿鞋是儿童用品中重要的一类，其质量安全对于儿童的成长和健康有重要的影响。儿童及婴幼儿群体处于生理、心理和认知成长的发育时期，受行为能力和心智水平的限制，自我保护意识较弱，极易受到外界环境和产品的影响和伤害[2]。例如婴幼儿好奇心强，有时会吸吮鞋子，这会使童鞋和孩子的皮肤，眼睛甚至口腔直接接触，从而导致鞋子表面上残留的有害物质伤害婴幼儿的身体健康，N-亚硝基胺就是其中一类。考虑到儿童群体的特殊性，若日常穿用的鞋的橡胶部件中N-亚硝基胺含量不符合要求，所造成的危害比成年人更加严重。因此应对儿童鞋中N-亚硝基胺含量高度重视。强制性标准GB 30585《儿童鞋安全技术规范》中要求，婴幼儿鞋橡胶部件中不应检出N-亚硝基胺。我国另外两个标准GB 250365-2010《布面童胶鞋》和GB 25038-2010《胶鞋健康安全技术规范》，也对橡胶部件中N-亚硝基胺规定为不得检出。

目前N-亚硝基胺的检测方法主要有分光光度法[3]、气相色谱-热能分仪仪联用法[4]、气相色谱-质谱联用法[5-7]、气相色谱-串联质谱法[8]、高效液相色谱法[9]以及液相色谱-串联质谱法[10]。由于气相色谱-热能分仪仪联用法仪器比较昂贵，且适用性比较窄，气相色谱-串联质谱和液相色谱-串联质谱法仪也比较贵，很多实验室也都不具备。GB 30585-2014中规定婴幼儿鞋中橡胶部件中亚硝基胺的检测方法为GB/T 24153给定的测试方法：气相色谱-质谱检测方法，是一个比较通用的方法，所用色谱柱也是实验室检测最常规的色谱柱类型。但实验研究发现，12种亚硝基胺物质中的其中两种亚硝基胺化合物N-亚硝基-N-甲基苯胺(NMPhA)和N-亚硝基-N-乙基苯胺(NEPhA)在标准规定的进样口温度为260 ℃下会分解成N-甲基苯胺(MPhA)和N-乙基苯胺(EPhA)，这是因为这两种物质具有热不稳定性[11]。因此，按照标准GB/T 24153[12]规定的方法实际样品检测中当检测出这两种物质时，有可能是样品种含有的MPhA或EPhA，就会造成假阳性结果。

本研究主要建立一种高效液相法来准确测定NMPhA和NEPhA，作为标准规定方法的一种补充，当用标准方法检测出这两种亚硝基胺时，进一步使用高效液相方法进行定性和定量，以避免假阳性的结果，提高检测准确度，满足检测需求。

1 实 验

1.1 主要仪器和试剂

仪器：Agilent 1260Infinity II超高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器；超声波清洗机，上海安谱实验科技股份有限公司；BUCHI R-300旋转蒸发仪，瑞士步琦有限公司；固相萃取装置：配有真空泵，上海安谱实验科技股份有限公司；XS204电子天平，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司。

试剂；甲醇，乙腈为色谱纯，TEDIA试剂有限公司；N-亚硝基-N-甲基苯胺NMPhA和N-亚硝基-N-乙基苯胺NMPhA、N-甲基苯胺(MPhA)和N-乙基苯胺(EPhA)标准样品，上海安谱实验科技股份有限公司；超纯水(MilliQ制备)。

1.2 标准溶液制备

分别准确称取每种亚硝基胺标准物质0.10 g(精确至 0.1 mg)，用甲醇定容至100 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液，装于棕色试剂瓶中保存。临用时根据需要将标准储备液用甲醇稀释成适当浓度的标准工作溶液。

1.3 样品溶液制备

按照GB/T 24153给定的方法制备试样溶液，整个实验的操作过程如下，取有代表性的试样，用适当工具碎至边长为 3 mm以下的颗粒，混匀。从混匀后的试样中称取5.0 g试料，至于锥形瓶中，加入30 mL甲醇，于超声波发生器中超声提取30 min，提取液转移至浓缩瓶中，再往锥形瓶中加入20 mL甲醇，重复提取一次，合并提取液。浓缩瓶置于旋转蒸发仪上，真空度控制在21.3～16.3 kPa，于35 ℃水浴中缓慢浓缩至稍少于4.5 mL，取下浓缩瓶，于漩涡混匀器上充分旋转振荡 1 min，将浓缩液中的样液移入5 mL棕色容量瓶中。另取0.5 mL甲醇淋洗浓缩瓶壁，于漩涡混匀器上充分旋转振荡1min后，移入容量瓶合并，用甲醇定容至5 mL，摇匀。将C18固相萃取小柱致于固相萃取装置上，用5 mL甲醇淋洗C18小柱。准确吸取2.0 mL样液注入小柱，流出液收集于离心管中。然后用缓慢氮气流吹至2 mL,样液摇匀后装入棕色进样小瓶中，密封冷藏待测。

1.4 仪器色谱条件

色谱条件：色谱柱Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；流动相：甲醇:水=65:35(体积比)；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；进样量10 μL；二极管阵列检测器检测。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

分别对NMPhA、NEPhA、MPhA以及EPhA标准溶液在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描，图1为NMPhA的光谱扫描结果，NEPhA的光谱扫描结果与NMPhA类似，图2为MPhA的光谱扫描结果，EPhA的光谱扫描结果与NMPhA类似。从图1和图2可以看出NMPhA、NEPhA和MPhA、EPhA的最大特征吸收波长不同，NMPhA和NEPhA在270nm处有强吸收，MPhA和EPhA在240 nm处有强吸收，由此可通过光谱定性鉴别NMPhA和MPhA、NEPhA和EPhA。为了更好的定性定量NMPhA和NEPhA，综合考虑选择检测波长为270 nm。

图1 NMPhA标准溶液光谱扫描图

图2 MPhA标准溶液光谱扫描图

2.2 色谱条件的优化

分别考察了乙腈:水=(65:35)、甲醇:水=(65:35)为流动相对两种亚硝基胺的分离效果，结果表明，两种溶剂都能够对两种亚硝基胺进行有效分离，但由于乙腈的淋洗能力较强，出峰时间相对甲醇较短，且标准中样品前处理萃取溶剂为甲醇，因此综合考虑选择甲醇/水作为流动相。

考察了甲醇:水比例分别为80:20、70:30、65:35、 60:40、50:50时两种亚硝基胺的分离效果，结果表明，甲醇:水比例分别为80:20、70:30时，出峰时间相对较短，峰形较窄，当甲醇:水比例为60:40、50:50时，出峰时间相对较长，特别是50:50时，无法在10 min内分离，同时峰宽相对较宽，综合考虑，选择甲醇:水=(65:35)作为流动相。

在优化的色谱条件下对四种浓度均为1.0 μg/mL的混合标准溶液进行测定，图3是四种混合标准溶液的液相色谱图，结果表明，在选定的色谱条件下可以有效分离四种标准物质，其中NMPhA和NEPhA保留时间分别为4.320 min和5.555 min，MPhA和EPhA的保留时间分别4.707 min和6.334 min。因此通过高效液相可以解决婴幼儿鞋橡胶部件中亚硝基胺气质检测中出现假阳性的问题。

图3 四种亚硝基胺液相色谱图

2.3 标准曲线、线性相关性及检出限

在选定的色谱条件下进一步对该分析方法进行方法学验证。

配置浓度均为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的NMPhA和NEPhA标准溶液，在优化的液相色谱条件下进样测定，以浓度x为横坐标，以峰面积为纵坐标y，进行线性回归计算，得到浓度-峰面积线性关系曲线，NMPhA的线性回归方程为：y=33.60270x-3.02975，相关系数R2为0.99949，NEPhA的回归线性方程为：y=23.90825x-3.12566，相关系数R2为0.99943，可见两种亚硝基胺的浓度和峰面积都呈现很好的线性关系，可以用来定量计算。

将一定浓度的两种亚硝基胺标准溶液逐级稀释并测定，根据信噪比(S/N)为3时对应的浓度确定为仪器的检出限，信噪比(S/N)为10时对应的浓度确定为定量限，利用仪器自带的软件进行信噪比计算得出NMPhA的检出限为0.01 μg/mL,定量限为0.03 μg/mL，NEPhA的检出限为0.04 μg/mL,定量限为0.11 μg/mL。根据1.3所述的前处理方法可知两种亚硝基胺的方法检出限分别为0.01 mg/kg和0.04 mg/kg.

2.4 检测方法的精密度、准确度

取经检测不含这两种亚硝基胺的婴幼儿鞋橡胶部件样品3份进行加标回收试验，加标浓度分别为0.3 mg/kg、1.0 mg/kg、5.0 mg/kg，按照1.3所述样品前处理方式进行萃取浓缩并上机定量测定，同时每个加标浓度分别重复测定7次，考察分析方法的精密度，结果见表1。

由表1可知，加标回收率在88.5%～108.6% 之间，RSD在0.86%～2.44%之间，方法具有较好的稳定性，表明所建立的分析方法得到的测定结果比较可靠。

表1 两种亚硝基胺的加标回收率和相对标准偏差实验结果

2.5 实际样品测定

从超市及批发市场等处随机购买20双婴幼儿童鞋，取其橡胶部件按照1.3所述方法进行前处理，并用建立的液相方法进行测定，结果均未检出这两种亚硝基胺。

3 结 论

N-亚硝基胺类是禁止在婴幼儿鞋橡胶部件使用的一类强致癌物质，其中N-亚硝基-N-甲基苯胺和N-亚硝基-N-乙基苯胺按照标准规定方法检测易产生假阳性结果，导致误判。因此，本研究建立了一种高效液相色谱法来分离和测定两种亚硝基胺，以甲醇:水=65:35(体积比)为流动相，在波长为 270 nm，流动相流量为1.0 ml/L，采用Eclipse XDB-C18色谱柱和二极管阵列检测器进行测定，两种亚硝基胺在0.2～ 10 mg/L范围下内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999，样品加标回收率在88.5%～108.6%，相对标准偏差RSD<5%，检出限分别为0.01 mg/kg和0.04 mg/kg。该方法可用于婴幼儿鞋橡胶部件中N-亚硝基-N-甲基苯胺和N-亚硝基-N-乙基苯胺的定性定量测定，避免假阳性结果，提高检测准确度。