过表达TaJRL53 基因提高了小麦赤霉病抗性

陈同睿 罗艳君 赵潘婷 贾海燕 马正强

南京农业大学农学院 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 江苏省现代作物生产协同创新中心, 江苏南京210095

植物在自然界生长过程中不断受到各种病原物的侵袭。在长期的进化过程中, 植物与病原物之间互相适应、协同进化。植物通过一系列信号传递激发自身的防御体系, 从而产生抗病反应, 例如水杨酸、茉莉酸、乙烯、钙离子等在抗病信号转导途径中扮演着至关重要的作用[1-2]。小麦, 作为世界三大粮食作物之一, 产量仅次于玉米和水稻。在过去的几十年间, 在小麦种植面积没有增加的前提下, 截至2017 年全球小麦总产量增长超过50%[3]。然而,它的生长过程受各种病原菌的侵害, 包括锈病、白粉病、赤霉病、纹枯病等。近年来, 随着全球气候变化、小麦耕作制度及农业生产技术变化的影响,小麦赤霉病的发生频率越来越高, 病害发生的面积逐渐增加。在我国, 赤霉病主要发生在长江中下游麦区、华南冬麦区和川滇冬麦区等。小麦赤霉病的发生不仅仅降低小麦的产量和品质, 更为严重的是感赤霉病的籽粒含有赤霉菌分泌的多种毒素如脱氧雪腐镰刀菌烯醇, 严重影响人畜健康[4-5]。鉴于赤霉病对小麦生产和粮食安全造成的严重威胁, 该病害引起了人们越来越多的关注。

凝集素是一类广泛存在于生物体内的糖蛋白或糖特异结合蛋白, 与机体的多种生理功能密切相关[6]。植物凝集素按照同源性、种属来源及进化关系的差异可分为12 个不同家族[7-8], Jacalin-related lectins (JRLs)是植物凝集素超家族中的一个新家族,因被发现于木菠萝而被命名[9]。根据其糖结合特性被划分为半乳糖特异性JRL (gJRLs)和甘露糖或葡萄糖特异性JRL (mJRLs), 前者是桑科植物特异的, 主要储存于液泡中[10]; 后者广泛分布于单子叶植物、双子叶植物、苏铁植物和蕨类植物, 大多数定位于细胞质和细胞核中。JRLs 蛋白结构具有多样性, 可包含一个或多个Jacalin 结构域[8,11], 也可与其他结构域嵌合。其中与疾病响应元件Dirigent 嵌合的JRL是单子叶植物特有的类型, 在单子叶植物中广泛存在, 又称为单子叶嵌合凝集素[12]。

迄今为止, 在植物中已有功能研究报道的JRLs超过26 个[13], 它们大多数都与抗病、抗逆及胁迫压力的响应相关, 但是它们抗病/逆的机制却各不相同。比如, 从红芸豆中提取的一种同源二聚凝集素,通过其自身的有毒肽对真菌Fusarium oxysporum、Coprinus comatus和Rhizoctonia solani的生长产生抑制作用[14]。LecRK-V.5 通过负调控拟南芥的气孔免疫, 从而对丁香假单胞菌和胡萝卜软腐菌的生长产生影响[15-16]。JAX1介导的免疫抗性不同于其他病毒抗性机制, 它独立于传统抗性(R)蛋白介导的抗性和植物防御激素信号传导[17-18]。辣椒中的甘露糖结合凝集素基因CaMBL1 通过识别高甘露糖型N-聚糖调控PCD, 进而对微生物病原体的防御反应[19]。凝集素受体激酶ERK1 在LysM 区域抗真菌MAMP 信号感知中发挥重要作用[20-21]。RTM1 通过与自身或RTM3 相互作用来限制植物病毒的长距离移动[22-24]。PYK10 通过与不同的JRLs (JAL31 和JAL23)互作,控制PYK10 聚合物的尺寸, 从而在防御反应中发挥作用[25]。OsJAC1 具有对多种病原菌的广谱抗性, 这种抗性是由自身的Jacalin 和Dirigent 两个结构域相互作用提供[26],OsMBL1可增强对稻瘟病菌的抗性,其抗性的产生是由于与稻瘟病基因MoChi1竞争几丁质, 从而触发水稻细胞中的ROS 反应, 并且通过积极调控SA 和ABA 响应基因, 进而通过参与PTI途径防御稻瘟病菌的侵染[27];LEM2参与了大麦系统获得性抗性[20]。

在小麦中, 目前为止仅有以下4 个JRL 基因被克隆并进行了功能及机制方面的探索:TaJRLL1与小麦白粉菌和赤霉菌抗性有关, 被认为是水杨酸和茉莉酸植物防御信号机制的组成部分[28];TaWC1-1基因响应白粉菌的侵染[29],TaHfr-1对黑森麦秆虫幼虫的发育有抑制作用[30];TaJA1是OsJAC1在小麦中的同源基因, 过量表达该基因可提高烟草对多种病害的抗性[31]。此外, 也有研究者在大麦、水稻、高粱、小麦和一些草属的NBS-LRR 区域发现了整合的Jacalin 结构域, 这类整合结构域, 有些可以诱捕入侵的病原体, 启动相应的防御响应[32-33]。我们前期研究从小麦基因组中鉴定获得了67 个JRL 基因, 其中TaJRL53是一个单拷贝基因, 位于小麦4A 染色体长臂上, 属于与Dirigent 结构域嵌合的mJRLs, 通过电子表达及RT-PCR 检测到TaJRL53可对赤霉菌的侵染产生响应, 并在MeJA 和SA 激素处理后上调表达[6]。本研究拟通过VIGS 技术和基因枪介导的遗传转化技术进一步探究TaJRL53的生物学功能以及抗性机制。

1 材料与方法

1.1 植物材料

普通小麦中国春和望水白用于该基因的克隆,地方品种望水白用于基因的组织特异性表达分析;中抗赤霉病材料SSD006 用于VIGS 实验; 感赤霉病材料Bobwhite 和PH691 用于稳定遗传转化。组织特异性表达分析的材料: 取望水白正常生长季节苗期根、茎、叶和开花后5 d 的根、茎、叶、穗于液氮冻存。转基因植株中TaJRL53的表达所用的材料: T0代转基因植株成株期的叶片。亚细胞定位材料用新鲜的洋葱。

1.2 基因的克隆

参照文献[31]获得的TaJRL53基因序列设计特异引物(F 引物: 5'-ATGGCCACAACCACCG-3'; R 引物: 5'-GATGGTATAAACACCAATCGAAG-3'), 从中国春的cDNA 中扩增TaJRL53的开放读码框。

1.3 总RNA 的提取、cDNA 的合成、半定量PCR和实时定量PCR

利用TRIzol 试剂(Invotrogen, Carlsbad, CA)按照操作说明提取总 RNA, 所有的 RNA 材料均用DNaseI (Fermentas, Canada)消化以确保完全去除DNA 污染。随后用M-MLV 反转录酶(Promega, USA)按照操作说明合成cDNA。

半定量RT-PCR扩增体系为25 μL, 反应程序为94℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 退火30 s (退火温度视具体引物而定), 72ºC延伸(延伸时间视扩增片段长度而定), 25～30 个循环(因基因的表达丰度不同而异), 最后72ºC延伸5 min。扩增产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳检测。以小麦组成型表达基因TaActin作为内参。

参照THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyoba,Japan)使用说明, 实时定量 RT-PCR 反应体系为20 μL, 包括约5 ng 模板、10 μL SYBR-Green PCR Mastermix (Toyoba, Japan)和各8 pmol 的正反向引物。以TaActin作为参照, 每个目标基因3 个重复, 相对表达量2−ΔΔCT方法计算[32], 用StepOnePlus Realtime PCR Systems (Applied Biosystems)进行反应。按[33]中所用引物对信号通路中的标志基因的表达进行检测, 检测TaJRL53表达的正向引物为5'-GTTGC CAAAACGCACGGTA-3', 反向引物为5'-CCCAGTC ATTATCTGCTTCATCCTC-3'。

1.4 载体构建

1.4.1 瞬时表达载体的构建 用KOD FX DNA聚合酶从望水白穗部cDNA 中扩增TaJRL53的编码区(不含终止子), 正向引物为5'-CTAGTCTAGA AT GGCCACAACCAC-3' (下画线表示XbaI 酶切位点),反向引物为5'-CGCGGATCC GATGGTATAAACA-3'(下画线表示BamHI 酶切位点)。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分离检测后, 用DNA 凝胶回收试剂盒回收, 将回收到的扩增产物用XbaI 和BamHI 酶切, 回收定量后与经过XbaI 和BamHI 酶切过的pEGFP 表达载体按3∶1 摩尔比混合, 在4°C 条件下用T4-DNA 连接酶(Promega, USA)连接过夜, 连接产物用热击法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α。阳性克隆送上海华大公司测序验证。

1.4.2 BSMV 沉默载体的构建 本实验室内野生型BSMV ND18 α、β 及γ 载体引自美国堪萨斯州立大学Scofield 实验室。利用DNA 聚合酶从中国春的cDNA中扩增TaJRL53, 上游引物 5'-CCCGTTAATTAA GCCACAACCACCGAAGAACC-3' (下画线表示PacI 酶切位点), 下游引物为5'-TATAGCGGCCGC CAG CACCGTCATAGACACCCC-3' (下画线表示NotI 的酶切位点), 将PCR 产物和野生型BSMV ND18 γ 用PacI 和NotI (Promega, USA)双酶切, 将载体去磷酸化, 分别回收酶切后的PCR 产物和质粒, 并按3∶1的摩尔比混合, 在4°C 条件下用T4-DNA 连接酶(Promega, USA)连接过夜。用热击转化法将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α。挑取阳性克隆送上海华大基因科技股份有限公司测序, 测序结果正确,获得可用于VIGS 转化的载体。

1.4.3 稳定表达载体的构建 用TaJRL53的特异引物从中国春的cDNA 中扩增TaJRL53的开放读码框, 正向引物为5'-TACGCTGCAG ATGGCCACAAC CACCG-3', 反向引物为5'-ATGCCTGCAG GATGGTA TAAACACCAATCGAAG-3' (下画线为PstI 的酶切位点)。将扩增片段插入到中间载体pUT (pTA2-Ubi-Ter)中构建Ubi驱动的表达盒, 然后将Ubi::TaJRL53-Ter表达盒用HindIII 切下, 再插入到表达载体pUCBS 中, 构成用于基因枪转化的TaJRL53稳定表达载体(图1)。

1.5 亚细胞定位

剥去新鲜洋葱最外的两层鳞茎, 用尖嘴镊子小心撕取完好鳞茎的内表皮, 平铺于1/2 MS 固体培养基上, 注意要将内表面朝上, 且要平铺于培养皿中心位置。盖上培养皿, 黑暗中 25ºC 恒温预培养2～4 h。参照文献[34]进行质粒包裹和基因枪轰击。将洋葱表皮细胞置于 25°C 恒温培养箱中暗培养16～18 h, 在激光共聚焦显微镜下观察荧光并照相记录。

1.6 VIGS

1.6.1 体外转录物的合成 提取野生型 BSMV ND18 α、β、γ 及BSMV:TaJRL53的质粒, 分别用MluI 线性化BSMV ND18 α、γ 及BSMV:TaJRL53质粒DNA,SpeI 线性化BSMV ND18 β 质粒DNA,用1%的凝胶电泳检测线性化水平。待线性化完全后用酚、氯仿抽提、纯化, 用RNase-free 水溶解, 调整浓度为0.2～1.0 μg μL–1。以抽提纯化的质粒为模板,用 T7-DNA 依赖的 RNA 聚合酶(mMessage mMachine T7 Kit; Ambion) 进行体外转录。转录产物用1% RNA-free 的凝胶电泳跑胶, EB 染色后在紫外灯下拍照检测RNA 质量。

野生型BSMV ND18 α、β 及γ 为模板的体外转录物与FES 按1∶1∶1∶25 的比例混合为空BMSV病毒对照, 同样以野生型 BSMV ND18 α、β 及BSMV:TaJRL53为模板的体外转录物与FES 也按1∶1∶1∶25 的比例混合, 取8 μL 上述两种混合液均匀液涂于穗部, 同时单独涂抹FES 缓冲液做空白对照。

1.6.2 体外涂抹 在抽穗期选取长势良好且大小一致的穗子, 分别涂抹FES 缓冲液、FES 缓冲液和BSMV 病毒混合液, FES 缓冲液和BSMV:TaJRL53病毒混合液, 以只涂抹FES 缓冲液和涂抹FES 缓冲液、BSMV 病毒混合液的植株作为对照组, 涂抹FES缓冲液和BSMV:TaJRL53病毒混合液的植株作为实验组, 每种病毒混合液至少接种10 株, 3 次重复。

1.7 小麦的遗传转化及转基因植株的检测

取开花后14 d 左右的小麦种子脱粒。在无菌条件下将脱粒的种子置于灭菌小罐中, 用70%乙醇浸泡5 min, 无菌水冲洗2～3 次; 2%的NaClO 浸泡8 min, 无菌水冲洗3～4 次。于2 mg L–12,4-D 的MS培养基上, 25℃暗培养3～5 d 后, 幼胚经过脱分化形成愈伤组织。参照文献[34]的方法基因枪轰击, 轰击后的小麦愈伤继续在25ºC 黑暗培养箱培养16～18 h,然后转移至诱导培养基上进行暗培养14 d。将愈伤组织转移到1 mg L–1KT 和20 mg L–1筛选剂G418的分化筛选培养基上, 在25ºC、12 h 光照条件下培养, 待愈伤分化出绿点后进行继代培养, 筛选4 周后将绿苗进行生根培养, 2 周后移栽到土壤中。

采用SDS 法提取受体材料和小麦再生植株的DNA[35], DNA 稀释后跑电泳检测质量和浓度, 用Ubiquitin 的正向引物 5'-ATCTCCCCCAAATCC ACCCG-3'和TaJRL53基因的反向引物5'-ATGCCTG CAGGATGGTATAAACACCAATCGAAG-3' 进 行PCR 检测, 同时以含有TaJRL53ORF 的载体质粒为阳性对照, 未转化的野生型植株DNA 为非转基因对照, 水为空白对照。PCR 总体积为25 μL, 包含模板、正反引物、r-TaqDNA 聚合酶和10×PCR 缓冲液。PCR 程序包括: 94ºC 预变性5 min, 94ºC 变性40 s, 60ºC 退火30 s, 72ºC 延伸2 min, 36 个循环, 最后72ºC 延伸5 min。PCR 产物在1%的琼脂糖凝胶电泳分离检测, 用EB 染色后在紫外灯下观察结果并照相。

1.8 赤霉病抗性鉴定

1.8.1 小麦叶片的赤霉病抗性鉴定 取T1代转基因株系返青至拔节期的小麦叶片接种赤霉菌孢子液, 孢子液为F15、F609、F7136 及F. grminearumtri5-GFP 菌株的分生孢子混合液, 接种时在叶片表面用枪头轻轻划伤, 悬空放置在培养基中间, 然后接种6 µL 浓度为1×106个 mL–1赤霉菌分生孢子的菌液。接种36 h 后观察赤霉菌菌丝的侵染情况。实验设置3 个重复, 每个重复中各接种5 个叶片, 差异显著性用t-test 进行检验。

1.8.2 小麦穗部的赤霉病抗性鉴定 采用单花滴注法对实验组和对照组长势一致的穗子接种赤霉菌,具体方法参照文献[36], 每个处理至少接种15 个穗子, 接种后7 d 和14 d 调查并记录病小穗数和病轴长, 每个转基因株系至少接种10 个穗子, 差异显著性用t-test 进行检验。21 d 时对接种的穗子进行拍照。

2 结果与分析

2.1 TaJRL53 的克隆和组织表达特异性

利用TaJRL53特异引物从普通小麦中国春穗部cDNA 中克隆获得了1056 bp 的全长序列,该序列与抗赤霉病种质望水白中的序列信息一致, 说明该基因序列在抗感材料中没有差异。对TaJRL53基因在苗期和开花期各组织中的表达进行分析, 以TaActin作为参照, 结果如图2 所示, 苗期主要在茎和叶片中表达(图2-A), 开花期的根茎叶穗4 个组织中, 穗部表达量最高(图2-B)。

2.2 TaJRL53 的亚细胞定位

为了研究TaJRL53蛋白在细胞中的表达部位,以PMD19-EGFP (35S::GFP)作为对照, 将TaJRL53的GFP 瞬时表达载体(35S::TaJRL53-GFP)转入洋葱表皮细胞后, 在激光共聚焦显微镜下观察,TaJRL53与GFP 均在整个细胞中发出绿色荧光, 尤其在细胞核上的荧光更为明显, 表明TaJRL53 分布于细胞质及细胞核上(图3), 是一个核-质蛋白, 与mJRLs 的亚细胞定位特点一致。

2.3 VIGS 介导TaJRL53 沉默后降低了植株赤霉病的抗性

接种 10 d 后, 涂抹 BSMV 病毒和 BSMV:TaJRL53病毒的麦穗出现病毒侵染后的表型。采用RT-PCR 法检测TaJRL53在籽粒中的表达水平, 与接种FES 缓冲液和BSMV 病毒的对照植株相比, 接种BSMV:TaJRL53病毒的植株中的TaJRL53的表达量显著降低, 表明TaJRL53的表达被成功抑制(图4-A)。各挑选长势一致的15 个植株用单花滴注法接种赤霉菌。接种3 d 后, 所有接种小穗可见明显的接种点。第7 d, 涂抹BSMV:TaJRL53病毒的植株, 其接种小穗上的赤霉菌由接种点扩展到邻近小穗, 穗轴呈褐色。至接种15 d, 只涂抹FES 缓冲液、涂抹FES 缓冲液和BSMV 空载病毒混合液及FES 缓冲液和BSMV:TaJRL53病毒混合液的植株病小穗数的平均值分别为1.3 个、1.3 个、2.4 个(图4-B), 差异达显著水平(P< 0.05); 病轴长分别为0.2、0.3、1.3 cm(图4-C), 差异达极显著水平。接种21 d 后, 涂抹FES缓冲液、FES 缓冲液和BSMV 病毒的混合液及FES缓冲液和BSMV:TaJRL53病毒混合液的植株病小穗数和病轴长差异最为显著(图4-D), 平均病小穗数分别为1.6 个、1.5 个和4.6 个(图4-B); 平均病轴长分别为0.3、0.3 和2.1 cm (图4-C)。

综上所述, VIGS 介导中抗赤霉病小麦SSD006中的TaJRL53沉默后, 小麦植株对赤霉病的抗性明显降低, 认为TaJRL53对小麦赤霉病抗性有重要影响。

2.4 小麦稳定转化及阳性植株的基因型和表型鉴定

采用基因枪法将TaJRL53过量表达载体导入到感赤霉病小麦品种Bobwhite 和PH691 中, 经愈伤诱导和连续的G418 筛选后, 对T0代抗性植株进行分子检测, 结果共获得6 株以Bobwhite 为受体的转基因植株, 1 株以PH691 为受体的转基因植株(图5-A)。利用RT-PCR 分析TaJRL53在各转基因植株中的表达水平, 结果表明7 个转基因植株的表达都明显高于受体, 以Bobwhite 为受体的转基因植株中编号为1 和2 的转基因植株表达量最高, 6 最低, 以PH691 为受体的转基因植株7 中的表达水平低于以Bobwhite 为受体的1～5 号植株), 略高于6 号植株(图5-B)。

为探究TaJRL53过量表达植株对赤霉病的抗性,取纯合转基因T1代株系六叶一心期的叶片在离体条件下接种含GFP 基因的赤霉菌, 36 h 后在荧光显微镜下观察发现, 非转基因对照Bobwhite 与以其为受体的转基因植株叶片均能观察到绿色荧光, 但转基因植株叶片上的荧光与对照相比明显弱(图6-A)。与对照菌丝完全遮盖接种点相比, 转基因株系仅能看见接种点, 其中Bobwhite 为受体的1、2 和4 号株系病斑面积显著减小, 差异在P<0.01 水平显著; 编号为3和5 的株系病斑面积在P<0.05 水平显著(图6-B)。阴性对照PH691 和以其为受体的7 号转基因植株在接菌之后菌丝均沿接种点向四周扩散, 但转基因植株菌丝扩散程度与对照相比较轻, 其病斑面积的平均值与对照相比小20%, 差异在P< 0.01 水平显著(图6-A, B)。

对纯合T1代转基因株系穗部采用单花滴注法接种赤霉菌, 接种10 d 后, 未转基因对照穗部的赤霉菌由接种点开始向临近小穗蔓延, 但转基因株系并未出现明显的赤霉菌扩展现象。接种14 d 后, 转基因株系与非转基因对照的病小穗数和病轴长差异显著(图6-C, D, E), 其中非转基因的Bobwhite 病小穗数平均为4.2 个, 病轴长平均为3.0 cm, 转基因株系的病小穗数平均值在1.7～2.0 个之间, 病轴长在1.4～2.5 cm 之间; 对照PH691 的病小穗数与病轴长的平均值分别为5.9 个和4.7 cm, 但以PH691 为受体的转基因植株的病小穗数和病轴长的平均值分别为1.0 个和1.6 cm, 与对照相比, 转基因植株的病小穗数与病轴长差异均在P< 0.001 水平极显著(图6-D, E)。

2.5 TaJRL53 过量表达的转基因植株中抗病信号途径相关基因的表达

为探究TaJRL53过量表达的转基因植株提高赤霉病抗性的分子机制, 对主要抗病信号途径SA、JA、ROS、Ca2+转运信号通路和木质素合成途径的标志基因进行了赤霉菌诱导后的表达分析。如图7所示, 当赤霉菌侵染TaJRL53过表达的转基因植株24 h 时, JA 信号转导途径中的基因12-OPR3、ACO以及效应基因ERF1、病程相关蛋白基因PR-3的表达均显著提高(图7-A～D)。对ROS 生成途径中的两个关键酶SAMDC、PAO 及与活性氧运输相关的Ca2+转运信号通路相关基因calcium-transporting ase1的表达进行检测, 发现这3 个基因在转基因株系中的表达量都显著高于非转基因对照植株(图7-E～G)。在SA 信号转导途径中除了病程相关蛋白基因PR1、PR2表达量显著提高外(图7-H, I), 效应基因Glu2、NPR1、EDS1(图7-J～L),SA合成相关基因ICS1和PAL等的表达都无显著差异(图7-M, N); 转基因植株与非转基因植株的木质素合成基因CCOMT表达水平无显著差异(图7-O)。由此初步推测TaJRL53提高小麦赤霉病抗性与JA 和ROS 信号途径以及病程相关蛋白有关。

3 讨论

尽管目前发现的JRL 凝集素存在于植物的多种组织, 但对于某一个特定的JRL 凝集素而言, 其在植物体内的表达往往仅限于某一个或少数几个组织,具有一定的组织特异性。Song 等[6]和Jiang 等[7]对JRL 基因在不同组织中的表达谱进行统计分析后发现, 21.4%的JRL 基因都具有组织表达特异性。例如Lem2在内外稃及胚芽中表达[40],MRL-1和MRL-2都在根中表达[41],TaJA1在叶鞘中表达[31]。本研究对TaJRL53的组织特异性表达进行分析, 发现TaJRL53苗期主要在茎和叶片中表达, 开花期在茎、叶、穗部都有表达, 但主要在穗部表达。

根据糖基结合的特异性可以将JRLs 划分为两类: 一类是半乳糖特异的jacalin 凝集素(galactosespecific jacalin-related lectins, gJRLs), 另一类是甘露糖或葡萄糖特异的jacalin 凝集素(mannose-specific jacalinrelated lectins, mJRLs)。现阶段所鉴定的JRLs 大多数属于mJRLs, 少数属于gJRLs。对水稻、拟南芥和小麦中的mJRLs 亚细胞定位结果显示大多数位于核/质间[39-41]。本研究通过洋葱表皮细胞亚细胞定位, 发现TaJRL53蛋白分布在细胞核/质中, 表明TaJRL53具有mJRLs 亚家族成员典型的蛋白定位特征, 初步推测TaJRL53属于mJRLs 亚家族成员。特异糖基结合试验有助于进一步确定该凝集素本身的性质。

Dirigent 蛋白通常被认为在木质素和木脂素的生物合成中起重要作用, 与Dirigent 结构域嵌合的JRLs 基因在植物的应激反应和发育中扮演着重要角色[12], 例如TaJA1, 及其在水稻和大麦中的同源基因OsJAC1、HvJAC1均具有广谱抗性[31,45]。TaJRL53的蛋白编码结构与TaJA1相似, 都具有 N 端的Dirigent 结构域和C 端的Jacalin 结构域[6]。本研究对TaJRL53的功能进行探究, 认为该基因参与对赤霉菌的防御过程, 对赤霉菌的侵染具有抗性。本研究首先采用BSMV 的方法降低TaJRL53在中抗赤霉病品种SSD006 中的表达, 发现植株对赤霉病的抗性降低。然后采用基因枪介导的遗传转化技术, 将TaJRL53过量表达载体转入感赤霉病品种Bobwhite和PH691 中, 分别获得6 株和1 株TaJRL53的过量表达植株。对T1代转基因植株采用离体叶片法和穗部单花滴注法接种赤霉菌鉴定转基因株系对赤霉菌的抗性, 离体叶片法接菌结果显示: 以Bobwhite 为受体的转基因株系其叶片上的荧光与对照相比明显减弱, 菌斑面积显著减小。阴性对照PH691 和以其为受体的转基因植株在接菌之后菌丝均沿接种点向四周扩散, 但转基因植株菌丝扩散程度与对照相比较轻。单花滴注法接种T1代小穗后, 结果显示转基因株系与对照均出现赤霉病的典型症状, 但转基因株系与受体亲本相比病害较轻。对T2代转基因株系的穗部接菌进行抗性鉴定, 各转基因株系与T1代的抗病趋势一致, 表明TaJRL53的转基因株系可以减轻由禾谷镰刀菌引起的病害。同时, 本研究发现两个不同背景的转基因株系抗病性存在差异, 这可能是因为两个受体材料对赤霉病的抗性和自身的组培性能存在差异, 转基因植株中TaJRL53的拷贝数不同造成的。

SA 和JA 介导的信号传导途径是植物在应对病原菌侵染时被激活的防卫途径, JA 在死体寄生和兼性寄生型病原菌侵染过程中起重要作用, SA 在活体寄生型病原菌的侵染过程中起重要作用, SA 和JA 途径均参与兼性寄生型真菌赤霉菌的侵染反应[46-47]。TaJRLL1是mJRLs 亚家族中的一员, 该基因通过参与SA 和JA 的植物防御信号机制的组成部分, 实现小麦植株对死体寄生的灰霉菌, 活体寄生的白粉菌以及兼性寄生的赤霉菌的抗性[28]。本研究对接种赤霉菌后的TaJRL53转基因植株的SA 和JA 信号转导途径相关基因的表达进行检测, 发现JA 信号转导途径主要标志基因的表达量与对照相比有所提高, 但SA 信号转导途径相关基因的表达并无明显变化。ROS 的产生是植物最早期的防御反应途径, ROS 的积累一方面可诱导防御基因的表达, 另一方面通过胼胝质沉积增加植物细胞壁的厚度[48]。在TaJRL53过量表达的转基因植株中ROS 生成途径的关键基因SAMDC和PAO的表达上调, 但是细胞壁合成相关的酶基因CCOMT并无表达变化, 说明TaJRL53过量表达只是改变了植株体内ROS 的产生水平, 并不影响细胞壁的合成。

综上所述,TaJRL53可能通过调控植物体内活性氧产生、JA 信号途径、诱导病程相关蛋白基因的表达水平, 从而提高植株对赤霉菌的抗性。但该基因的赤霉病抗病机制还不清楚, 其发挥作用的结构域是Dirigent 还是Jacalin 或是共同作用还不得而知,碳水化合物结合蛋白作为mJRLs 细胞活动中的关键物质, 其结合特异性在植物防御机制中的作用今后还有待阐明。

4 结论

通过VIGS 技术和基因枪介导的遗传转化技术证明TaJRL53与赤霉病的抗性呈正相关, 赤霉菌侵染转基因株系后, ROS 和JA 信号途径相关基因表现出上调趋势, 说明TaJRL53可能是通过参与ROS 合成途径和JA 信号转导途径来提高转基因植株对赤霉病的抗性。