棉花GbSTK 基因调控开花和黄萎病抗性的功能研究

崔 静 王志城 张新雨 柯会锋 吴立强 王省芬 张桂寅 马峙英 张 艳

华北作物改良与调控国家重点实验室 / 河北省棉花产业协同创新中心 / 河北农业大学, 河北保定 071001

棉花(Gossypiumspp.)是世界上重要的经济作物,我国是棉花生产、消费、纺织品出口大国, 然而我国棉花生产面临黄萎病危害依然严重, 近年来新疆棉区发病面积迅速扩大, 危害日益加重, 因此对抗病品种的需求是生产上解决棉花抗黄萎病的根本。为了提升我国棉花在国际市场的竞争力, 棉花机械化的不断推进以促进植棉节本增效, 然而棉花播种覆盖的地膜成为机采过程中的严重白色污染, 造成棉花品质大幅下降, 为了从根本上缓解这一矛盾,早熟棉的培育与应用显得尤为重要。因此, 抗病、早熟性研究是棉花要解决的重大生产和科学问题。

早熟性是作物重要的优良性状之一, 棉花的生育期包括营养生长(播种到现蕾)和生殖生长(开花到吐絮) 2 个阶段。现有的棉花资源中发现早熟品种多抗性差、抗病品种多贪青晚熟; 并且植物本身也存在抗病–发育的调节平衡, 逆境条件下, 多数植株也会以暂停或减缓生长发育为代价而抵御逆境。建立抗病与早熟之间的联系、打破早熟与抗病的负相关、发掘同时控制开花与抗病的遗传因子对培育早熟抗病的品种具有重要意义。

蛋白磷酸化是真核生物中普遍存在的细胞调节机制[1]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase, STK)是蛋白磷酸化过程中一类重要的蛋白因子[2], 在细胞信号传导中起着重要作用[3-4]。目前, STK 在番茄[5-6]、水稻[7-8]、番木瓜[9]、拟南芥[10]、小麦[11-12]、烟草[13]、百合[14]等植物中均有发现, 研究表明STK 参与植物抗病、干旱、光照等多个信号传导途径。本课题组前期鉴定了一个棉花丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(GbSTK), 该基因受黄萎病菌和多种信号分子诱导, 转GbSTK基因的拟南芥显著提高了植株黄萎病抗性, 有趣的是发现转基因拟南芥与对照相比, 开花期明显提前, 因此, 本研究进一步研究STK基因在棉花抗黄萎病和调控植株开花的功能, 以期为深入揭示棉花STK基因的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转GbSTK基因拟南芥纯合株系[15]、黄萎病不同抗性棉花品种均由河北农业大学棉花遗传育种创新团队提供。强致病力黄萎病菌系LX2-1[16]由本实验室分离保存。EASYspin Plus 植物RNA 提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司; PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)反转录试剂盒购自宝生物工程有限公司;2×Phanta Master Mix 购自南京诺唯赞生物科技有限公司; 限制性内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司; T4 DNA 连接酶购自普洛麦格公司;pMD19-T 载体、大肠杆菌DH5α 感受态细胞、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司; Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System、诱饵表达载体pGBKT7、Aureobasidin A (AbA)、X-α-Gal 购自Clontech 公司; Y2HGold 感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。引物合成和测序由生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 黄萎病菌诱导下不同抗、感棉花品种STK 基因的表达

采用水培法种植棉花不同抗、感品种, 每2 d 更换1 次Hoagland 营养液。待棉苗二叶一心时, 将棉苗轻轻拿出, 将根部浸泡在黄萎病菌孢子悬浮液(1×107spores mL-1)中3 min, 然后再将棉苗小心栽入上口直径6 cm 的营养钵, 并从营养钵的底部再次注射10 mL 的黄萎病菌孢子悬浮液, 以保证每棵棉苗成功接菌(附图1)。根据实验室前期构建的全长黄萎病菌诱导下cDNA 文库中筛选的抗病相关基因的表达中发现, 参与防卫反应的基因一般在抗/耐病品种较感病品种的表达高峰出现早或表达水平高, 而前期我们对棉花STK受黄萎病菌诱导的荧光定量PCR 显示, 在接菌后8～12 h, 其表达显著升高[15],考虑到STK基因主要在参与信号转导方面起作用,其发挥作用一般在接菌后的早期阶段, 因此本研究取接菌后12 h 的根并提取其RNA, 用于研究多个抗感品种中STK基因的表达。根据GbSTK基因序列设计实时定量引物STK-F2 和STK-R2 (表1), 片段大小为200 bp 左右。根据PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)反转录试剂盒合成cDNA。以棉花GhUBQ14[17]为内参基因(表 1),qRT-PCR 反应体系为10.0 μL, 包含1.0 μL cDNA、5.0 μL 2×SYBR、0.5 μLSTK-F2 primer、0.5 μLSTK-R2 primer、2.8 μL RNase-Free H2O、0.2 μL ROX校正液。反应程序为94℃预变性30 s; 95℃变性5 s,57℃退火5 s, 72℃延伸34 s, 40 个循环。试验设置3个生物学重复, 采用2–ΔΔCt方法[18]计算STK基因的相对表达量。

1.3 棉花中病毒诱导的STK 基因的沉默

根据GbSTK基因的序列信息, 设计病毒诱导的基因沉默载体(VIGS)引物VF/VR (表1), 并克隆目的片段。将目的基因片段和pTRV2 载体分别用SpeI和AscI 进行双酶切, 分别胶回收基因条带和pTRV2载体, 用T4 连接酶在16℃过夜连接, 构建成沉默载体pTRV2-GbSTK(TRV::GbSTK)。将连接产物转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞, 通过PCR 检测和阳性克隆测序鉴定得到序列正确的克隆。

将构建好的pTRV2-GbSTK质粒和pTRV1 分别转化农杆菌GV3101, 保存备用。种植抗病农大棉601, 待棉苗2 片子叶平展但第1 片真叶未长出时,分别沉默TRV::GbSTK(试验组)、TRV::00(空载体对照组)和TRV::CLA1(环境对照组), 具体操作参照Zhang 等[19]方法。待沉默TRV::CLA1的植株新生叶片出现白化, 说明目的基因被有效沉默, 此时, 进一步通过qPCR 确定试验组植株的沉默效率。分别选取沉默效果好、长势整齐一致的植株, 按照Zhang等[20]的方法对GbSTK沉默植株和对照植株接种黄萎病菌孢子悬浮液(×107spores mL-1), 在接菌20 d和25 d 后观察植株发病情况并计算病情指数。

1.4 转STK 基因拟南芥早花性状的鉴定

分别种植转STK基因拟南芥纯合株系和空载体对照拟南芥, 定期观察拟南芥的长势, 记录拟南芥莲座叶的数目和开花时间。用EASYspin Plus 植物RNA 提取试剂盒提取转基因株系和空载体对照拟南芥的总 RNA, 以TUB2为内参基因(表 1), 利用qRT-PCR 检测拟南芥中开花相关标志基因FT和SOC1的表达量, 比较转基因植株和对照拟南芥开花途径标志基因的表达量。

1.5 STK 酵母双杂交载体的构建与转化

将含有正确GbSTK序列信息的质粒和pGBKT7载体分别用NdeI 和PstI 进行双酶切, 胶回收GbSTK基因条带和pGBKT7 空载体条带, 借助于T4连接酶在16℃过夜连接, 将连接产物转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞。利用pGBKT7 载体的通用引物BD-F/BD-R (表1)检测阳性克隆, 并对PCR 阳性克隆提取质粒DNA 进一步测序验证。挑选测序正确的克隆, pGBKT7-GbSTK提取质粒DNA, 按照说明书转化Y2HGold 感受态细胞。

1.6 诱饵蛋白毒性和自激活检测

参照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作手册, 以共转pGBKT7-53+pGADT7-T 酵母菌作为阳性对照, 共转化pGBKT7-Lam+pGADT7-T 酵母菌作为阴性对照。将空载体 pGBKT7 和pGBKT7-GbSTK分别转入Y2HGold 酵母菌株中, 涂于SD/-Trp 平板上, 置于30℃培养箱倒置培养3～5 d,检测诱饵载体pGBKT7-GbSTK有无毒性[21]。

挑取平板上生长状态良好的pGBKT7-GbSTK单克隆, 在 SD/-Trp 液体培养基中培养, 涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 平板上, 置于30℃培养箱倒置培养3～5 d, 检测诱饵载体pGBKT7-GbSTK有无自激活活性[21]。

参照Clontech 公司酵母双杂交操作指南, 将携带pGBKT7-GbSTK诱饵载体的Y2HGold 与黄萎病菌诱导海岛棉酵母双杂交cDNA 文库进行杂交, 依次涂布于DDO (SD/-Leu/-Trp)、TDO (SD/-His-/Leu/-Trp or SD/-Ade/-Leu/-Trp)、QDO/X/A (SD/-His-/Ade/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)平板上, 置于30℃培养箱倒置培养3～5 d, 观察菌落生长情况和菌落颜色变化。

利用pGADT7 通用载体引物T7/3′AD (表1)对所筛选到的单克隆进行PCR 鉴定, 对获得的PCR 阳性克隆进行测序, 测序结果在Cotton FGD (https://cottonfgd.org/)数据库中进行BLAST比对, 初步确定互作蛋白的基因及蛋白信息。

2 结果与分析

2.1 不同抗性棉花品种中STK 基因的表达

选取不同抗性棉花品种, 根据STK在接菌后12 h 出现表达峰值[15], 对根中STK基因的表达检测结果表明,STK基因在不同抗性品种中均有表达, 在感病品种邯208 中表达量最低, 不同抗性的棉花品种中STK基因表达量不同程度的明显高于邯208,其中抗病品种农大棉8 号表达量最高, 其次是抗病品种农大601 (ND601), 在农大棉7 号(NDM7)、农大棉10 号(NDM10)、农大棉13 号(NDM13)、国欣棉9 号(GXM9)、宁棉9 号(NM9)、冀棉169 (JM169)共6 个耐病品种中的表达也呈现较高的表达水平(图1)。黄萎病菌诱导下,STK基因的表达水平在抗性好的棉花品种显著高于感病品种, 说明STK基因的转录水平与棉花抗黄萎病反应呈正相关关系。

表1 试验中所用引物Table 1 Primers used in the study

2.2 沉默棉花内源STK 基因显著增强了植株感病性

以抗病农大601 为材料, 待两片子叶完全展平且第1 片真叶未长出时进行VIGS 处理, 以沉默CLA1为可视化对照。VIGS 处理7 d 后, 注射CLA1的棉苗第1 片真叶出现网格状的白化现象(图2-a),说明基因被VIGS 体系有效沉默。此时取沉默棉株及对照棉株的第1 片真叶提取RNA, qRT-PCR 检测结果表明, 沉默棉株中GbSTK基因的表达量明显低于对照(图2-b), 说明GbSTK在棉株中被沉默。对沉默棉株及对照棉株进行黄萎病菌胁迫处理。在接菌处理25 d 的病情指数调查结果表明, 沉默棉株比对照植株表现出明显的叶片黄化、植株萎蔫的典型黄萎病症状(图2-c), 2 次独立的基因沉默试验中对照棉株的病情指数分别为25.7 和29.3 (平均27.5), 而沉默STK基因的棉株的病情指数分别65.3 和61.1 (平均63.2) (图2-d～e)。表明棉花STK正向调控了棉花对黄萎病的抗性。

2.3 GbSTK 促进转基因拟南芥提早开花

相同生长条件下, 定期观察STK基因拟南芥纯合株系和空载体对照拟南芥的长势, 记录拟南芥莲座叶的数目和开花时间。结果显示, 转基因拟南芥比对照提早开花5～7 d (图3-a～c)。开花时统计转基因株系和野生型拟南芥的莲座叶数目发现, 转基因拟南芥叶片数平均为7.5 片, 明显少于野生型的莲座叶片数(11.9 片) (图3-d), 表明转GbSTK基因可显著提早拟南芥的开花时间。进一步利用qRT-PCR 检测拟南芥开花标志基因FT、SOC1和LFY基因的表达量发现, 转基因不同株系中FT和SOC1基因的表达水平显著高于对照植株, 而LFY基因的表达受影响较小(图3-e～g), 表明STK基因可以影响开花关键基因FT和SOC1的表达水平, 进而在调控植株开花时间中发挥作用。

2.4 pGBKT7-GbSTK 毒性和自激活检测

利用pGBKT7 载体的通用引物BD-F/BD-R (表1)检测获得诱饵载体阳性克隆(图4-a～c), 提取阳性克隆质粒DNA 测序验证, 测序结果与预期结果大小一致。将空载体对照pGBKT7 与诱饵载体pGBKT7-GbSTK分别转化Y2HGold 感受态, 涂布于SD/-Trp平板上。在30℃培养箱倒置培养3～5 d 后发现, 诱饵载体的平板与空载体的平板菌落生长状态基本一致(图4-d), 表明诱饵载体pGBKT7-GbSTK没有毒性。

自激活试验表明, 阳性对照 p G B K T 7-5 3/pGADT7-T 在SD/-Leu/-Trp 平板上可以长出白色菌落(图5-a), 在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal 长出蓝色菌落( 图 5-b), 阴性对照 pGBKT7-Lam/pGADT7-T 只能在 SD/-Leu/-Trp 平板上生长,pGBKT7-GbSTK与阴性对照一致。而且诱饵载体pGBKT7-GbSTK在SD/-Trp/X-α-Gal 上正常生长且不显示蓝色, 在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 上不能生长(图5-c), 表明pGBKT7-GbSTK没有自激活活性。

2.5 pGBKT7-GbSTK 互作蛋白筛选与分析

将携带诱饵载体pGBKT7-GbSTK的酵母菌液和黄萎病菌诱导的海岛棉Pima90-53 cDNA 文库杂交,将菌液依次涂布于DDO、TDO、QDO/X/A 平板上,在30℃培养箱倒置培养3～5 d, 最终挑选生长良好的蓝色菌落(图6: 部分筛选结果), 进行菌落PCR 鉴定, 获得105 个阳性克隆, 对105 个克隆进行测序,序列信息通过棉花Cotton FGD (https://cottonfgd.org/)数据库比对分析, 筛选到30 个可能与GbSTK 互作的蛋白(表2)。通过NCBI 比对, 根据同源蛋白功能类似的特点发现, 这30 个蛋白可以大体上分为6 类:第1 类包括细胞色素氧化酶(cytochrome C oxidase)和苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase), 它们在ROS 的产生中具有明确的功能报道; 第2 类主要是参与防卫反应或应对生物/非生物胁迫的成员; 第3类主要为参与此生代谢合成的基因; 第4 类蛋白在调节植物生长发育和胁迫相应均具有功能; 第5 类蛋白在调节植物生长发育中有功能报道; 第6 类是目前没有明确的功能报道的一类。这些蛋白为深入揭示GbSTK 的蛋白调控网络奠定了基础。

3 讨论

自然条件下, 植物生长发育面临生物和非生物胁迫等复杂的环境, 植株为了增强生存能力, 在长期的植物进化过程中形成了一套成熟的适应机制,即通过能量和物质的重新分配来有效调控生长与发育的平衡。传统观点认为, 植株抗病性与品种早熟性存在此消彼长的关系, 认为抗病植株易贪青晚熟,早熟性好的品种抗性比较差, 犹如鱼和熊掌不可兼得[47]。随着人们对基因调控网络的不断建立和深入,一些突破性研究进展正在冲击人们的传统认识, 正如普遍认为植物抗病与产量之间呈现难以打破的负相关, 最新发表在Science的研究报道表明[48], 水稻IPA1基因既能提高水稻产量又能增强对稻瘟病的抗性, 打破了不可能同时实现增产和抗病的传统观点, 这也为育种家突破传统认识, 将之前多年来育种上的不可能逐渐变为可能提供了启发。本研究发现, 棉花丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(GbSTK)具有调节黄萎病抗性和植株早花的双重功能, 为从理论上打破抗病性与品种早熟性负相关提供了有潜力的基因资源。

本课题组前期基于SSH 文库筛选到GbSTK基因, 该基因可以显著提高拟南芥的黄萎病抗性[15]。本研究在此基础上进一步研究发现, 抗性较好的多个棉花品种中STK基因表达水平均不同程度高于感病对照, VIGS 试验进一步证明, 沉默棉花内源STK基因显著降低了植株的抗病性, 表明GbSTK正调控棉花黄萎病抗性。酵母双杂交互作蛋白筛选试验初步筛选到30 个与GbSTK 存在互作关系的蛋白, 大多数蛋白的功能尚未报道。其中, 我们筛选到的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthase,SAMS)目前已有研究。SAMS 是植物代谢中的关键酶, 催化甲硫氨酸和 ATP 合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)[49]。SAM 不仅为DNA、RNA、蛋白质提供了甲基, 而且还是多胺、乙烯、生物素等物质合成的前体物质[50-51]。表明SAMS基因参与植物响应生物与非生物胁迫。在拟南芥中,FER 通过与SAM1 和SAM2 酶相互作用, 抑制了SAM 的合成, 降低了乙烯水平, 从而控制了植物的发育[52]。大豆在水分和干旱胁迫下,SAMS参与应激反应调控, 3 种S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白在水分和干旱胁迫下表达分别下降、增加[53]。张悦等[54]研究表明, 刚毛柽柳S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因ThSAMS参与了对盐和干旱的胁迫应答。董先娟等[55]发现, 盐、干旱、低温以及重金属胁迫均能够提高AsSAMS1的表达和SAM 的积累; 茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸、赤霉素信号均可诱导白木香愈伤组织中AsSAMS1基因的表达。本课题组也发现, 陆地棉GhSAMS基因在棉花抗黄萎病反应中起着重要作用[35]。本研究基于酵母双杂交筛选的与 GbSTK 互作的SAMS 蛋白和GhSAMS 蛋白的同源性为99.28%推测(附图2), GbSTK 蛋白可能通过与SAMS 蛋白互作,从而起到抗黄萎病作用, 也为深入研究GbSTK 蛋白的抗病机制奠定了基础。

表2 与GbSTK 互作的候选蛋白Table 2 Candidate proteins interacting with GbSTK

FLOWERING LOCUS T(FT)基因在植物中广泛存在, 作用于多种调控途径的下游, 包括CONSTANS(CO)光周期诱导途径, 是促进开花的所必需的信号整合因子[56]。CO 蛋白在长日光条件下激活FT基因表达, FT 蛋白被运送到筛管中, 最终通过韧皮部运输到茎尖分生组织和FD 蛋白结合, 共同作用调控下游花器官相关基因AP1、SOC1等基因的表达, 从而促进拟南芥开花[57]。本研究发现, 转GbSTK基因的拟南芥比对照提早开花5～7 d, qRT-PCR 分析拟南芥开花关键基因的表达水平发现,GbSTK基因可以显著提高拟南芥FT和SOC1基因的转录水平, 促使植株提早开花, 这也首次揭示了一个具有抗病功能的棉花基因具有提早植株开花的功能。

本研究初步证明了棉花GbSTK基因具有同时提高抗性和提早开花的功能, 并为进一步研究该基因的分子机制提供了初步线索, 深入研究GbSTK基因的功能和分子机制, 将为抗病早熟育种提供重要理论基础和实际应用新途径。

4 结论

GbSTK基因正向调控棉花黄萎病抗性, 沉默棉花内源STK基因可显著降低植株抗病性; 超表达GbSTK可以增强开花关键基因FT和SOC1的表达,进而调控植株提早开花。酵母双杂交初步筛选出30个与GbSTK 互作的候选蛋白, 主要涉及参与ROS合成、生物非生物胁迫、次生代谢、生长发育等几类功能蛋白。