不同提取条件对黄连中小檗碱含量的影响

张小斌，雷艳妮，陈书存

(1.商洛学院 健康管理学院、中国中医科学院商洛中药材GAP科研工程中心,陕西 商洛 726000；2.商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西商洛 726000；3.商洛市中医医院，陕西 商洛 726000)

黄连属毛莨科植物(Cop tisch inen sis Franch)、三角叶黄连(Coptis deltoid ea C1Y1Cheng etH siao)、云南黄连(Coptis teetaWall)的干燥根茎，在《神农本草经》中有很高的药用价值，是植物药材中的上品。根茎性质属寒，味道较苦，对于调节人体心脾肝胃等器官有很大的良性作用，人们最常用黄连来去火，利用的就是它清心除烦、泻火解毒的功效[1]。黄连含有的成分较为复杂，其中人们常用的就是黄连碱、非洲防己碱等，小檗碱在所有成分中含量最高，约为3%～9%[2]，药理研究表明小檗碱具有显著的抗肿瘤作用、对糖尿病、肠道、心血管均有作用，抗脑缺血，抗血小板、抗炎、抗脑缺血等作用[3～7]。目前小檗碱提取方法主要有渗漉法、有机溶剂法、浸渍法、水提取法、稀硫酸法[8]等。笔者采用回流提取法，不仅效率较高，可以减少提取过程投入的时间与人力投入，还可以深入研究盐酸小檗碱的提取过程优劣之处，盐酸小檗碱作为黄连的有效成分，研究过程应该重点完善其提取过程，通过改变影响提取的主要因素—溶剂浓度和提取时间来分别采用紫外分光光度计法[9]测定黄连中小檗碱的含量，优选最佳提取条件，给我国医学领域黄连资源的开发制造更多助推力，提供更多具有较高价值的实验依据。

1 材料和仪器

1.1 药材与试剂

药材: 目前，黄连饮片的供给方为商洛国药控股企业，经商洛学院生物医药与食品工程学院制药工程系鉴定为毛茛科植物黄连(Cop tisch inen sis Franch)的干燥根茎。

试剂：小檗碱标准品(批号 110713-201212，中国药品生物制品检定所)；甲醇(利安隆博华(天津)医药化学有限公司)、无水乙醇(利安隆博华(天津)医药化学有限公司)、95%乙醇(利安隆博华(天津)医药化学有限公司)、盐酸(西陇化工股份有限公司)。

1.2 实验仪器

755B紫外可见光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；石英比色皿；电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂，型号HHS-11-2);索氏提取器；循环水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ))；移液管(0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL、10 mL)、10 mL容量瓶若干、100 mL容量瓶若干、吸耳球、滤纸(9 cm)等。

2 实验方法

2.1 不同条件黄连中小檗碱的提取

(1)精密称取黄连粉末10 g，以滤纸包裹放进专业提取器里，常用的提取器为索氏提取器，量取无水乙醇与盐酸比例为100∶1的溶剂100 mL置于250 mL的圆底烧瓶中，在80 ℃水浴锅中回流提取，提取时间分别设定为1 h、2 h、3 h。

(2)精密称取黄连粉末10 g，同上采取相同处理方法，量取95%乙醇与盐酸比例为100∶1的溶剂100 mL置于250 mL的圆底烧瓶中，在80℃水浴锅中回流提取，提取时间分别设定为1 h、2 h、3 h。

(3)精密称取黄连粉末10 g，以滤纸包裹采用同上的相同处理方法，量取75%乙醇与盐酸比例为100∶1的溶剂100 mL置于250 mL的圆底烧瓶中，在80℃水浴锅中回流提取，提取时间分别设定为1 h、2 h、3 h。

2.2 含量测定方法

2.2.1 测定波长的选择 将称取量定为两毫克，称取对象为标准盐酸小檗碱，将足量的盐酸小檗碱放于容量瓶中，容量瓶量程为50 mL，采用水浴加热的方法使盐酸小檗碱充分溶解。放冷，加甲醇至刻度，以甲醇为空白溶液，波长范围为300～600 nm，在该范围内扫描溶液，扫描结果表明，当波长为345 nm时，溶液的吸收峰最大，因此选择345 nm作为盐酸小檗碱的测定波长。

2.2.2 制备盐酸小檗碱标准品溶液 使用专业手法称取标准盐酸小檗碱，称取质量为10 g，将称取后的盐酸小檗碱放于容量瓶里，容量瓶量程选为250 mL，同样进行水浴加热处理使得盐酸小檗碱可以充分溶解，放冷，加甲醇至刻度，制成浓度为0.040 mg·mL-1的溶液，放置一旁作为备用品。用精密仪器从溶液中量取小剂量试剂，从1 mL到5 mL，将这五种剂量的溶液均放置在容量瓶中，容量瓶量程选为10 mL，用甲醇定容至刻度，待测。

2.2.3 标准曲线的绘制 精密量取已配置好浓度的标准溶液，空白对照溶液选择甲醇溶液，测定当扫描波长为345 nm时送我的的吸光度。将测量结果绘制出函数曲线，纵坐标为吸光度，横坐标为溶液浓度。

表1 盐酸小檗碱的标准曲线

图1 盐酸小檗碱标准曲线

2.2.4 制备实验所需供试品溶液 保证精确度的前提下，量取上述黄连提取液0.1 mL，放于容量瓶中，容量瓶量程选为100 mL，向容量瓶中添加甲醇直到溶液达到刻度线处，摇晃均匀。以无水乙醇1 h为起始，75%乙醇3 h为终止编号(1、2、3、4、5、6、7、8、9)。

2.2.5 供试品溶液的含量测定 精密量取一定量制备好的盐酸小檗碱供试品溶液9份，将甲醇作为实验的空白溶液，采用方法为紫外分光光度法，在345 nm波长处测定吸光度，并且将盐酸小檗碱的含量计算出来。

计算方式：

A=49.993C+0.0289，含量M测=(C×V1×V2)/1000，W(%)=(M测/M称)×100%(V1:提取液的体积；V2:吸取0.1mL溶液稀释体积)

2.2.6 稳定性实验 精密量取75%乙醇提取3 h的提取溶液0.1 mL，将其放于容量瓶里，容量瓶量程选取为100 mL，向容量瓶中添加甲醇，室温避光放置，分别于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，将扫描波长控制在345 nm，测定此时的吸光度。测定结果如下，溶液吸光度大体上没有改变，这说明供试品具有较强的稳定性。

表2 稳定性实验

2.2.7 精密度实验 精密量取已配好浓度为0.04 mg·mL-1的盐酸小檗碱标品溶液4 mL，放于容量瓶中，容量瓶量程为10 mL，向容量瓶中添加甲醇溶液，直到溶液达到刻度线，将扫描波长控制在345 nm，测定此时溶液的吸光度。结果见表3，吸光度值基本无变化，说明仪器具有良好的精密度，实验结果参考价值较高。

表3 精密度实验

2.2.8 重现性实验 精密称量黄连粉末10 g 5份，以75%的乙醇为提取溶剂，提取3 h后取提取液，吸取提取液0.1 mL，分别放于五个容量瓶中，容量瓶量程均为100 mL，向容量瓶中添加甲醇溶液，直到溶液达到刻度线，将添加过甲醇溶液的容量瓶试剂作为实验的空白对照，扫描波长控制在345 nm，测定此时溶液的吸光度，结果见表4，吸光度值无变化，表明此法重现性良好。

2.2.9 加样回收率实验 精密量取供试品75%乙醇3h提取液0.1mL，置于100 mL容量瓶中，分别加入浓度为0.04 mg·mL-1的盐酸小檗碱标品溶液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL，添加甲醇溶液，直到平视时溶液达到刻度线位置，将量取的甲醇溶液作为实验的空白对照溶液，将扫描波长控制在345 nm，测定此时的吸光度，根据测量结果计算出实验回收率。结果见表5，表明该方法准确度高，可靠性强。

3 结果分析与讨论

3.1 提取条件不同对盐酸小檗碱在黄连成分中占比大小的影响结果

不同提取条件对黄连中盐酸小檗碱含量的影响结果见表6和图2。

由表6和图2可以看出，75%的乙醇为提取溶剂，提取时间为3h时，提取的盐酸小檗碱含量最高，达12.42%。三种不同浓度的乙醇溶剂提取，小檗碱含量从高到低顺序依次为75%乙醇﹥95%乙醇﹥无水乙醇；不同提取时间进行提取，小檗碱含量从高到低顺序依次为3h﹥2h﹥1h。

图2提取条件不同对盐酸小檗碱在黄连成分中占比的影响

3.2 分析与讨论

3.2.1 黄连品种不同造成其含有的盐酸小檗碱量的不同 根据前人[10,11]对不同品种黄连药材的测定结果发现，黄连的细分种类不同，其含有的盐酸小檗碱的量也不同，在已知的黄连中，云连中的盐酸小檗碱含量排名第一，第二为雅连，盐酸小檗碱含量最少的是味连，虽然云连中含量最高，但是云连的产量低，而味连的产量较高，因此在实验中选择味连作为实验药材。

3.2.2 选择不同的提取溶剂给提取率带来的影响 在温度较高的纯净水或者温度较高的乙醇溶液中，盐酸小檗碱具有更高的溶解度，当温度降低其溶解度也随之减少，在实验中，可以深入研究甲醇与乙醇的差别，选择更合适的提取溶剂。甲醇具有毒性并且使用甲醇作为溶剂会增加成本投入，不仅保障不了安全性还会影响到其他实验用品的选取，因此实验的提取溶剂定为乙醇。

3.2.3 含量测定方法的选择 盐酸小檗碱的含量测定方法有多种[12]，采用紫外分光光度法相对于其他方法而言操作简便，灵敏度高，结果可靠，将该方法用于测定盐酸小檗碱在黄连中的占比，得出的结果具有较高参考价值。

4 结论

4.1 最佳提取条件的确定

提取条件为75%的乙醇溶液、提取时间为3h，盐酸小檗碱含量最高，达12.42%，可作为黄连中小檗碱的最佳提取条件，亦为中药黄连制剂生产提供实验依据。

4.2 含量测定方法

在实验中，提取盐酸小檗碱的方法大多为乙醇回流法，因为该方法步骤简单且提纯率较高，通过紫外分光光度法在345 nm处测其吸光度值，能够有效的计算出盐酸小檗碱在黄连的所有成分中含量占比多少。此法简便实用，结果可靠，可以给医学领域开发黄连资源提供助推力，值得推广。