蛹虫草菌糠制备虫草肽酵素饮料的研究

雷燕妮，张小斌，杨 梅，陈书存，陈冬平，李多伟,6

(1.商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000；2.陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院，陕西 商洛 726000；3.商洛学院 健康管理学院, 陕西 商洛 726000；4.西安宇沐生物技术研究院有限公司，陕西 西安 710068；5.商洛市中医医院，陕西 商洛 726000；6.西北大学 生命科学学院，陕西 西安 710069)

蛹虫草是一种大型药食用真菌，其体内所含的虫草素经过科学的检查和实验发现，能够有效的抑制细菌的滋生，并且还能抵抗病毒，遏制肿瘤生长[1～3]，降低高血糖患者体内的血糖含量，医学作用十分巨大[4]；而其所含的虫草多糖同样也具很强的保健功效和医药价值，比如说皮肤抗皱、延缓机体衰老、提高免疫力及增加抗癌能力，对于患有癌症的病人也有一定的遏制病情发展的能力。蛹虫草人工栽培过程中有大量废弃的菌糠产生，目前，食用菌菌糠主要用于加工饲料或生产有机肥料。而且经过研究和分析得到，即使无法作为药品使用的废弃菌糠内也会还有一定量的虫草素和虫草多糖，除此之外还有大量的具有价值的物质[5]，如蛋白质、脂肪酸等等。蛹虫草菌糠有别于其他食用菌菌糠，在蛹虫草栽培中完全采用食品如大米、小麦和蚕蛹粉等，无其他抗菌、杀菌的化学添加剂成分，因此，蛹虫草菌糠在食品、饮品中应用将会具有很好的经济效益[6]。

目前，市场上流通的受到很多消费者喜爱的保健品一般原料都是酵素，酵素是将水果或蔬菜在有益菌的帮助下进行发酵，而完成发酵后的产物将会具有多种对人体有益的微生物，即人们所说的酵素。关于酵素的作用，除了最常见的延缓衰老、增强免疫力、抑制细菌滋生、净血等保健功效外，还有消炎、抗癌等医学功效，因此其十分受消费者的喜爱[7，8]。不过，对于将菌糠制作成为饮料这一方式，并没有丰富的研究资料可供参考，也没有专业的研究所对其进行充分的实验。笔者研究为能够实现酵素饮料的大面积生产提供一定的参考价值，开辟出新的菌糠利用途径。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与设备

1.1.1 材料 蛹虫草菌糠：由徐州鸿宇农业科技有限公司提供；果胶酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶：南宁东恒华道生物科技有限责任公司,MRS固体培养基,MRS液体培养基,安琪高活性果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳杆菌:陕西省微生物所提供。

1.1.2 仪器与设备 植物粉碎机(FZ102)；冰箱(BCD-245/H)；高压蒸汽灭菌锅(SX-280A、上海申安医疗器械厂)；超净工作台(SW-CJ)；超声清洗器(KQ-50DB)；磁力加热搅拌器(DF-10IS)；恒温振荡器(THZ-92A、上海博迅公司)；紫外可见分光光度计(UV-1700)；电子分析天平(SPS202F)；电热鼓风干燥箱( DHG-9070A)及电热恒温培养箱(DNP-9052A)均采购自上海鸿都电子科技有限公司；高速离心机(LD5-10、北京医用离心机厂)；蒸馏水器(DE-10、上海悦丰)；手动单道可调式移液器(PotPette 100-1000μl、上海大龙医疗器械有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.2 操作要点 主要有:

(1)蛹虫草菌糠肽液的制备。选取无污染的蛹虫草菌糠粉碎成粗粉，按料液比1∶10、1∶8煮提，煮提时间120 min、90 min，煮提液过滤，用20%盐酸溶液或20%的氢氧化钠溶液调节煮提液pH至 6.5左右，按体积比加入1‰中温型α-淀粉酶,于60～70℃水解2 h，除去煮提液中的淀粉(产品中过多淀粉的存在会严重影响酵素减肥的功效)，在用20%盐酸溶液或20%的氢氧化钠溶液调节淀粉酶水解液pH至7.5左右，按体积比加入1‰植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等)，35～45℃酶解3 h，使淀粉酶水解液中虫草蛋白水解为虫草蛋白肽，制成蛹虫草菌糠肽液，低温保存备用。

(2)发酵液的接种和发酵。取蛹虫草菌糠肽液200 mL于500 mL三角瓶中，121℃灭菌30 min，待灭菌液温度降至30℃以下时接入3%～5%的乳酸菌菌液，有氧发酵30～36 h，在接入0.10%～0.15%的酵母菌菌液继续发酵24～36 h。通过不同的参数组合得出在不同接种量、发酵问题、发酵时间等条件下，乳酸菌和酵母菌数量的变化，以及常规pH、SOD酶的活性、产物酸度数值等参数的变化。

(3)蛹虫草菌糠肽酵素饮料的制备 上述工艺制得的蛹虫草菌糠肽酵素液，用柠檬酸和甜菊糖调配酵素液口感。通过加入含量的不同从而得到口感和气味不同的产品，并利用全因子实验获得具体的加入量，再以感官评定确定某一组的测试者评分。

1.2.3 测定方法 主要有:

(1)酵素液中酵母菌含量的测定,按照GB 4789.15-2016 操作。

(2)酵素液中乳酸菌含量的测定,按照GB 4789.35-2016操作。

(3)酵素液中S0D活性的测定,按照GB/T 5009.171-2003操作。

(4)酵素液中酸度的测定方法, 按照GB/T 12456-2008操作。

(5)酵素液中pH的测定方法,按照GB/T 12456-2008操作。

2 结果与讨论2.1 酵母菌发酵条件的优化

在单因素对发酵影响实验的基础上，为进一步探讨各工艺条件相互交叉对发酵的影响，我们以SOD活性为指标,选择酵母菌接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)3个因素,每个因素选择3个水平,按正交试验L9(33)表进行实验, 通过正交试验考察酵母菌发酵的最佳工艺参数，发酵正交实验因素水平表和结果分析表见表1。

表1 正交L9(33)及结果分析

表1极差分析可以看出，B>A>C为各因素对SOD活性影响的顺序。对于酵母菌来说，发酵温度最为重要，其次是菌的接种量和发酵时间。根据全部实验中得出的最佳组合A3B3C2即接入0.15%的酵母菌后，在30℃的条件下发酵15 h，即可得到最佳的酵母菌发酵产物。

2.2 乳酸菌发酵条件的优化

在单因素对发酵影响实验的基础上，为进一步探讨各工艺条件相互交叉对发酵的影响，我们以酸度为指标,选择乳酸菌接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)3个因素,每个因素选择3个水平,并按照实验表安排数值进行正交试验，以此来确定最佳的乳酸菌发酵工艺参数。具体数值安排和实验结果如下表：

表2极差分析可以看出，A>C>B为各因素对酸度影响的顺序。对于乳酸菌来说，接种量的影响相对于两者是最主要的，而发酵的温度改变并不会对结果产生较大的影响。根据最优全部实验总结出的最优组合为A3B1C2即接入6%的乳酸菌后在30℃的条件下发酵35 h，就可以得到最优的乳酸菌发酵产物了。

表2 正交L9(33)及结果分析

2.3 复合菌发酵结果

在利用蛹虫草菌糠肽液进行发酵的过程中，使用了多种发酵菌，因此要根据不同菌种的营养吸收速率安排出不同的发酵时间和发酵条件，从得到的多个实验组中挑选出最佳的一组。总发酵时间定为40 h，发酵条件为充分溶氧、为菌种选择最合适的温度、最佳pH的条件下，分别先后接入乳酸菌和酵母菌进行发酵研究其不同接种时间对乳酸菌和酵母菌数量的变化以及常规PH、SOD酶的活性、产物酸度数值等参数的变化的影响，具体的试验因素及结果见表3。

表3 复合菌发酵试验结果

表3可以看出，SOD活性高的为试验2号和3号，试验2号SOD活性已达到452.05 U·g-1，为最高值;试验1～4号以达到工厂生产要求即酸度都达到0.50%以上，试验1号已达到0.58%，为最高值。

2.4 蛹虫草肽酵素饮料调配结果

取发酵蛹虫草菌糠肽液适当稀释，按适当比列加入甜菊糖、柠檬酸进行饮料的口感调配。根据评分方法(表4)进行效果评价，之后将加入的因素水平表和结果总结至表5。

表4 蛹虫草肽酵素饮料的感官评分标准

表5 蛹虫草肽酵素饮料调配全因子试验结果

从蛹虫草肽酵素饮料调配全因子试验结果可得到，当添加量为0.1%的甜菊糖，0.3%柠檬酸时，所获得的评分是全部实验中最高的。

表5感官评定可以看出，实验号2味道合适，但气味并不十分明显；实验号4则气味和味道都是不特别的突出；实验号3经过测试者品尝使用后，发现不仅味道可口，而且香气扑鼻；试验5～8号蛹虫草肽酵素饮料风味太浓郁。所以说，制作成实验号3的方式是最合适的生产方式，不仅口味独特，而且伴有浓郁的蛹虫草香味，经酸糖调配获得风味适宜并伴有浓郁虫草香味的酵素饮料。

2.5 产品指标

2.5.1 感官指标 气味：具有明显的虫草味和发酵气味；色泽：以金黄色为最佳；口感：无异味且酸甜度合适，口感绵柔顺滑；质地：无杂质、沉淀、分层情况的出现，应是澄清的金黄色液体。

2.5.2 理化指标 总酸>0.35%；pH 3.0～4.0；可溶性固形物≤10%。

2.5.3 微生物指标 乳酸菌活菌数≧12.8×109CFU·mL-1；细菌总数(个·mL-1)≤100；大肠杆菌(个·L-1)≤3；致病菌未检出。

3 结论

根据以上的分析可知，由于菌类其本身具有不同的特性，所以说如何满足其发酵条件以及安排发酵时间是最主要的调配酵素饮料的技术难关，而笔者研究经过试验测得的最佳发酵安排：第一步是在30℃的条件下，加入6%的植物乳杆菌发酵30 h，第二步在第一步的乳酸菌发酵完成后再加入0.15%的酵母菌发酵10 h，温度仍为30℃保持不变。

蛹虫草肽酵素饮料调配最佳配比为用0.1%的甜菊糖和0.3%的柠檬酸对蛹虫草肽酵素进行调配，可获得风味适宜，酸甜可口、且伴有浓郁的虫草香味的蛹虫草肽酵素饮料。