丙烯酰胺对小鼠肠道屏障损伤作用

雷艾彤，苏 丹，聂春超，郭子妍，元同骥，陈 奕

(南昌大学食品学院，江西 南昌 330047)

丙烯酰胺(Acrylamide,AA)是常见的工业助剂[1]，在化工、纺织、废水处理、医疗美容等各行各业中均有普遍应用[2]。研究表明丙烯酰胺具有多种毒性，例如神经毒性[3]、遗传毒性[4]、生殖毒性[5]、致癌性[6]、致畸性[7]等，并且可以在体内蓄毒，会引起急性、亚急性和慢性中毒[8]。自瑞典研究人员于2002年首次在油炸马铃薯中发现丙烯酰胺后，各国食品领域的研究者们陆续在食品中检测到丙烯酰胺的存在，进一步证实了其在饮食中的暴露情况。研究表明，经高温烹调的淀粉类食品中均含有丙烯酰胺，这主要是天冬门酰胺和还原糖美拉德反应的结果[9-10]。丙烯酰胺的日常暴露给对人类带来了潜在的重大风险，同时也是食品安全研究人员亟待解决的重要命题。在1994年，丙烯酰胺被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)列为人类可能致癌物质(2A类)[11]。由于各地区饮食习惯以及生活环境差异，不同人群丙烯酰胺暴露情况差异较大[12-13]。我国在最新膳食研究中得出的丙烯酰胺日均摄入量为0.319 μg/(kg bw·d)[14-15]，显著低于世界平均水平1 μg/(kg bw·d)[16]。目前大多数对于丙烯酰胺肠道屏障损伤的研究停留在体外实验，体内研究还不够深入[17-18]，对于不同剂量暴露下的损伤情况对比也鲜有报道。

本研究通过建立不同浓度下丙烯酰胺染毒模型，对不同暴露量下小鼠机体情况及肠道损伤程度进行对比。检测不同剂量丙烯酰胺在氧化指标、组织结构、蛋白表达等层面对肠道屏障损伤的程度，评估丙烯酰胺剂量与肠道屏障损伤情况的关系。为后续研究丙烯酰胺的膳食预防和天然活性物质的毒性控制提供理论基础和研究依据。

1 实验方法

1.1 材料与试剂

丙烯酰胺(纯度>99.9%)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

雄性KM小鼠，5周龄，20.0±2.0g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司(生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002)。动物实验均按南昌大学动物伦理评审委员会批准的程序和许可(SYKX-2015-0001)进行。

Anti-ZO1紧密连接蛋白抗体、Anti-Occludin抗体、Anti-Claudin 1抗体、Anti-MyD88抗体、Anti-TLR4抗体、Anti-NF-kB p65抗体均购于英国Abcam公司。辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司。过氧化氢酶(Catalase，CAT)、微量还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、D-乳酸试剂盒购于南京建成生物工程研究所；BeyoECL Star(特超敏ECL化学发光试剂盒)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、BCA蛋白浓度试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司；D-乳酸酶联免疫吸附测定试剂盒购于武汉博士德公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

3K15高速台式离心机(德国Sigma公司)、3001全波长扫描式多功能读数多功能酶标仪(美国Thermo公司)、A10超纯水仪(美国Millipore公司)、2HWY-2102生化培养箱(上海森信实验仪器公司)、KZ-II组织破碎仪(武汉塞维尔生物科技有限公司)、AL104型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)、RE-52AA旋蒸仪(上海亚荣生化仪器厂公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 动物模型的建立

选用KM小鼠，体重20.0±2.0 g，共计25只，在温度25 ℃±2 ℃，湿度%的环境下，12/12 h昼夜循适应性静养一周后，随机分为正常组(C组)、低剂量组(L组)、中剂量组(M组)、高剂量组(H组)。正常组灌胃等体积生理盐水；低剂量组灌胃浓度为10 mg·kg-1·bw的丙烯酰胺水溶液、中剂量组灌胃浓度为20 mg·kg-1·bw的丙烯酰胺水溶液、高剂量组灌胃浓度为30 mg·kg-1·bw的丙烯酰胺水溶液。每天灌胃1次，持续30 d。末次灌胃24 h后对小鼠进行最后1次称重，摘眼球取血后，颈椎脱臼处死。并立即解剖收集小肠等脏器，置于-80 ℃储存。分组及模型建立如图1所示：

图1 动物模型建立

1.3.2 小鼠一般行为情况观察

在实验期间观察并记录小鼠每日精神状态、行为表现、毛发光泽度、进食情况，有无死亡情况等，有明显行为差异情况拍照记录。

1.3.3 小鼠体重及肝脏指数的测定

静养1周后，从第8天开始于每日灌胃前对小鼠进行称重记录，并将体重数据绘制成图，观察实验期间小鼠体重变化情况。

将解剖分离的肝脏经生理盐水漂洗后，用滤纸吸干多余水分并称重记录。将肝脏重量(mg)与体重(g)的比值表示肝脏指数数值：器官指数=器官重量/小鼠体重。

1.3.4 小肠病理变化检查

取小鼠小肠空肠部分约2 cm左右组织，于生理盐水中轻轻漂洗，祛除表面血迹。放入10%中性福尔马林溶液中固定。用石蜡包埋，切片，苏木素-伊红(hematoxylineosin，HE)染色、马松(Masson)染色，光镜下观察并拍照。

1.3.5 小肠组织氧化指标测定

称取100 mg左右小肠组织，按照m:v=1:9的比例加入同等体积的生理盐水，加入钢珠后于60 Hz条件下破碎6 min，后于8 000 r·min-1，4 ℃条件下离心15 min。吸取组织上清液，参考说明书测定SOD、CAT、GSH和MDA含量。

SOD酶活力单位定义：在黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(unit)。CAT酶活性单位定义：在25 ℃，pH=7.0的条件下，在1 min内可以催化分解1 μmol过氧化氢定义为一个酶活力单位(μnit)。

1.3.6 小肠通透性情况测定

血样在室温下静置2 h，随后在4 ℃，6 000 r·min-1条件下离心10 min，获得血清。参考说明书步骤测定血清中D-乳酸含量。

1.3.7 紧密连接蛋白Western Blot的检测

(1)提取组织样品蛋白

称取小肠组织50 mg按比例m:v=1:10加入500 μL IP裂解液，再加入比例为ip:PUSF=100:1的PMSF防止组织蛋白质被蛋白酶融解；

将裂解液的肠组织破碎器70 Hz 120 s进行破碎，4 ℃，10 000 r·min-1离心4 min。取400 μL上清液加入空白EP管内，按比例5:1加入80 μL 6x SDS蛋白上样缓冲液；

金属浴95 ℃，6 min后快速预冷放入-20 ℃冰箱储存。

(2)制胶

表1 SDS-PAGE制胶配方

(3)上样与电泳

S1:80 V,25 min; S2:120 V，1 h。

(4)转膜与孵育

采用半干转，将PVDF膜剪好后置甲醇中浸泡活化，按照滤纸PVDF膜-胶-滤纸，形成“三明治”结构转膜后，在1%牛血清蛋白中，室温封闭40 min。

孵育一抗：将PVDF膜分别孵育在配好的一抗工作液(一抗：TBST=1:1 000)中(或按照说明书要求)，4 ℃过夜(或按说明书要求)。次日回收一抗工作液，加入适量的TBST置摇床上洗膜，10～15 min/次，重复3次。

孵育二抗：将PVDF膜分别孵育在配好的二抗工作液(二抗：TBST=1:10 000)中，(注意不同的一抗对应的二抗)室温摇床40 min(或1 h，看说明书具体要求)。加入适量的TBST，置摇床上洗膜，15 min/次，重复3次。

(5)显影

将BeyoECL Star (特超敏ECL化学发光试剂盒)显影A液：B液=1：1的比例配制ECL工作液，均匀加到PVDF膜上，置于BioRad凝胶成像系统中进行曝光。

1.4 数据处理与分析

所有数据采用SPSS 16.0软件分析，并重复3次，结果以平均值±标准差来表示；采用Graph Pad Prism 6软件作图；采用单因素方差分析和Tukey’s多因素t检验进行方差分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与讨论

2.1 小鼠一般表观情况观察及死亡率

在丙烯酰胺造模期间，高剂量组于第28天、第30天分别出现一只中毒死亡的小鼠，其余各组均无小鼠死亡。L组的小鼠在实验全过程中并未出现明显的异常行为；M组自染毒第22天、高剂量自染毒第15天起，出现聚团取暖、嗜睡怕冷、后肢乏力、尿量增多、暴躁易怒、毛发凌乱无光泽等现象。在造模后期，M、H组内瘫痪情况普遍，小鼠失去正常行动能力。这表明丙烯酰胺的蓄积毒性开始体现。有专家学者基于生理学毒性代谢动力学模型及非线性计量反应法神经毒性边际剂量为40 μg/(kg bw·d)[19-20]，本实验得出小鼠在20 mg·kg-1·bw剂量下持续染毒22 d、30 mg·kg-1·bw剂量下持续染毒15 d即出现明显神经毒性症状。

2.2 不同浓度AA致小鼠体重变化及肝脏指数变化

如图2所示，在实验造模前所有小鼠经过7天静养后，体重均为(31.0±2.0) g。在灌胃造模最初13 d内，所有组别的小鼠体重正常上升。在(13～20) d，3个丙烯酰胺组的体重上升趋势较正常组稍有放缓。在20 d后，H组体重持续下降，在30 d时体重较正常组下降16.7%；L组和M组体重上升趋势变化不明显。表明在10 mg·kg-1.bw剂量下，30 d的实验期间丙烯酰胺在小鼠体内的蓄积毒性在体重减少上体现并不明显。在20和30 mg·kg-1·bw

天数/d图2 不同剂量丙烯酰胺致小鼠体重变化情况

剂量下，分别于20和15 d有影响体重增长的情况出现，尤其在高剂量组小鼠的体重较正常生长趋势下降十分显著(P<0.05)。

肝脏是体内的重要解毒器官，因此肝脏也是丙烯酰胺重要的靶器官。前期研究也表明，丙烯酰胺会导致肝脏损伤，肝功能受损[21]。因此本实验测定了小鼠的肝脏指数，结果如图3所示。正常组小鼠的肝脏指数为51.3 mg·g-1，高于3个模型组，肝脏指数也随着丙烯酰胺的浓度上升而下降，并且高剂量组肝脏指数较正常组显著下降(P<0.05)，且观察到肝脏组织颜色较正常组明显加深、表面颗粒状组织明显。与前期研究观察到丙烯酰胺致肝脏损伤的表观情况一致[31]。表明10～30 mg·kg-1.bw的丙烯酰胺连续造模30 d均会造成肝脏损伤，不同程度的影响肝脏的组织结构。

AA/(mg·kg-1)#P<0.05,##P<0.01，下同。图3 不同剂量丙烯酰胺致小鼠肝脏指数变化情况

2.3 不同浓度AA致小鼠小肠组织病理变化情况

小肠是机体中最重要的吸收器官之一，绒毛-隐窝轴作为肠黏膜的基本功能单位，肠绒毛的高度决定了小肠与营养物质的接触面积。本实验通过HE染色法观察小鼠小肠组织结构形态，如图4A所示，正常组的小肠绒毛排布整齐有序，规则清晰。而随着丙烯酰胺浓度上升，各模型组小肠绒毛长度呈显著下降。小肠绒毛排布混乱，且高剂量组上皮细胞边界模糊，肠道机械屏障明显受损。以上结果表明丙烯酰胺会对小肠上皮造成损伤，降低绒毛高度、加宽隐窝宽度，影响肠道正常组织结构，且呈剂量依赖性。通过Masson染色法观察小鼠小肠组织的纤维化情况，结果由图4B所示，但小肠组织纤维化并不明显。以上结果表明，丙烯酰胺会明显损伤肠黏膜组织结构，破坏小肠黏膜机械屏障，尚未观察到明显的纤维化病变。

2.4 不同浓度AA致小鼠小肠氧化损伤

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)属

(A)组织形态观察(200×)

(B)纤维化情况观察(200×)图4 不同浓度丙烯酰胺对小肠组织结构和纤维化影响

于内源性抗氧化酶，可以保护机体免受自由基的侵害，并且在对抗脂质过氧化和过氧化氢的有害生理效应中发挥重要作用[22]。还原型谷胱甘肽(GSH)是机体内最重要的非酶性抗氧化物，同时也是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的底物。SOD将ROS转化为过氧化氢，然后CAT和GSH-Px将其降解为水和氧[23]。丙二醛(MDA)是一种脂质过氧化产物，也是反映生物体内氧化应激情况的重要生物标志物[24]。

如图5所示，与正常组相比，各丙烯酰胺组中MDA含量均显著(P<0.05)升高，高剂量组极显著升高(P<0.01)。且经丙烯酰胺造模后，小肠组织中抗氧化酶CAT和SOD含量显著降低(P<0.01)，抗氧化物GSH的含量也有不同程度降低，且高剂量组明显低于另外两个剂量组。这些结果表明，丙烯酰胺会造成小鼠小肠组织脂质过氧化，降低抗氧化酶活性，破坏正常体内的氧化还原系统，从而造成小鼠小肠氧化损伤。并且也有研究显示丙烯酰胺会造成小鼠体内脂肪消化吸收相关通路标志蛋白的差异性表达，这与MDA的实验结果相吻合，证明脂肪的代谢可能是丙烯酰胺造成小肠损伤的作用途径之一[25]。

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

2.5 不同浓度AA致小鼠肠道通透性变化

作为肠道中普遍的细菌发酵代谢产物，D-乳酸可由肠道中多种细菌形成[26-27]。在日常食物摄取后较少被吸收，且体内无法将其快速降解。肠道中的D-乳酸会在肠黏膜受损导致肠道通透性增加时进入血液，使血浆中D-乳酸水平升高[28]。因此，血液中的D-乳酸水平可以作为监测肠黏膜损害程度和通透性的指标。如图6所示，丙烯酰胺造模后的各组血清中D-乳酸的含量较正常组均有上升，其中低剂量组上升差异性最为明显。表明丙烯酰胺会增加肠黏膜的通透性，破坏小肠机械物理屏障功能，导致肠道内的细菌代谢产物透过肠黏膜进入血液中，造成血清内抗原含量上升，打破机体内原有的免疫平衡。而低剂量血清中D-乳酸水平高于中、高剂量组，猜测可能是由于丙烯酰胺改变了肠道中的肠道菌群组成，从而影响细菌产物，造成D-乳酸的生成量下降。

AA/(mg·kg-1)图6 不同浓度丙烯酰胺致小鼠血清中D-乳酸含量的影响

2.6 不同浓度AA对小鼠肠道紧密连接蛋白的影响

紧密连接(Tight junction)蛋白是小肠细胞表达的一类与肠道通透性和机械屏障密不可分的蛋白，他们能够通过建立固有层来有效抵御肠道内的毒素和微生物病原体等等[29]，这也是肠道保护中最重要的防御屏障。肠上皮细胞间主要通过紧密连接蛋白相连。因此紧密连接蛋白的表达情况能够切实的表明肠道受损程度和通透性情况，当紧密连接蛋白的表达下降时，肠上皮细胞间的间隙会增大，肠道通透性会上升，此时表明肠黏膜受到破坏。因此其是评价肠道健康程度的重要指标和评价标准。紧密连接蛋白存在于上皮细胞的顶端，由跨膜蛋白和外周蛋白间相互作用而成，受多种机制共同调控。其中ZO家族是最主要的紧密连接蛋白家族[30]，而ZO-1是家族中维持细胞形态的重要组成部分，它可以与Occludin相结合确保肠上皮细胞的完整性和封闭性。

通过western blot手段对各组间Claudin、Occludin及ZO-1紧密连接蛋白的表达进行检测。可以通过图7看到，丙烯酰胺诱导后，各组中3种紧密连接蛋白的表达都有显著下降，并且下降程度和丙烯酰胺浓度呈正相关。这表明丙烯酰胺浓度越高，给小鼠小肠造成的损伤越严重，这与3.3中小肠组织切片结果一致。表明丙烯酰胺产生的体内毒性会降低小肠组织中紧密连接蛋白的表达，通过影响紧密连接蛋白的方式增大上皮细胞间间隙，造成肠道通透性升高，损伤小肠机械屏障。后续可能会造成肠道内的病原体进入体液循坏，打破体内免疫平衡。

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)图7 不同浓度丙烯酰胺致小鼠肠组织紧密连接蛋白的影响

3 结论

综上所述，本研究发现10～30 mg·kg-1·bw剂量范围内丙烯酰胺连续灌胃30 d均会对小鼠小肠造成不同程度的损伤。当日剂量达到30 mg·kg-1·bw时，连续灌胃30 d，会造成小鼠体重明显下降，全部出现后肢瘫痪等症状，甚至有死亡情况。此外，丙烯酰胺会破坏机体内抗氧化平衡，丙烯酰胺染毒后小肠组织出现明显病理损伤，绒毛长度变短、排列杂乱，但尚未造成明显肠道纤维化病变。并且会通过降低紧密连接蛋白的表达造成肠黏膜上皮细胞间隙变大，增加肠道通透性，造成肠道机械屏障损伤。还会导致肠道内微生物产物进入体液循环中，破坏体内免疫平衡。以上研究表明高于10 mg·kg-1·bw剂量单位的丙烯酰胺持续摄入30 d后均会造成小鼠小肠屏障损伤。