高效液相色谱法同时测定喉康散中靛蓝和靛玉红含量

李 玲，王婷婷，陈乃江

（江苏省连云港市食品药品检验检测中心，江苏 连云港 222006）

喉康散处方来源于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂（第五册）》，由冰片、硼砂、青黛、玄明粉、珍珠层粉等10 味中药组方，用于治疗急、慢性咽炎，喉炎，扁桃体炎，口腔溃疡等咽喉疾病［1］。方中，青黛味咸，性寒，具有清热解毒、凉血消斑、泻火定惊等功效，主要活性成分为脂溶性成分靛蓝和靛玉红［2－5］。由于市售的青黛药材质量差异大，造假严重，伪劣品较多［6］。现有质量标准中仅采用薄层色谱法对靛蓝和靛玉红进行定性鉴别，缺乏对制剂中有效成分的含量测定［1］。本研究中建立了同时测定喉康散中靛蓝和靛玉红含量的高效液相色谱法，以改进现有质量评价方法，确保产品质量可控。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国沃特世公司），配有Waters 2998 光电二极管阵列（PDA）检测器，Empower 色谱工作站；Sartorius BP211D 型电子分析天平（德国赛多利斯公司，精度为十万分之一）；KH－700DE 型数控超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为700 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

靛蓝对照品（批号为 110716－201612，纯度为98.7%），靛玉红对照品（批号为 110717 －201805，纯度为99.6%），均购自中国食品药品检定研究院；喉康散（市售，桂林葛仙翁药业有限公司，批号分别为180407，181217，190112）；N，N －二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 － 0.05 moL ／L 醋酸铵溶液（75 ∶25，V ／ V）；流速：1.0 mL ／ min；检测波长：289 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。取阴性对照品溶液、对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定，理论板数按靛蓝和靛玉红峰计均不低于3 000，拖尾因子均不超过1.5。色谱图见图1。可见，靛蓝与靛玉红及相邻色谱峰均能完全分离，且阴性对照无干扰。

图1 高效液相色谱图1.indigotin 2.indirubinA.Mixed reference solution B.Test solution C. Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制备

取靛玉红对照品21.44 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加DMF 适量，超声（功率为700 W，频率为40 kHz）使溶解，稀释至刻度，摇匀，作为靛玉红对照品贮备液。取靛蓝对照品28.32 mg，精密称定，置 200 mL 容量瓶中，加 DMF 适量，超声使溶解，精密量取靛玉红对照品贮备液10 mL，置同一200 mL 容量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。精密量取混合对照品贮备液5 mL，置25 mL 容量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，即得靛蓝和靛玉红质量浓度分别为28.32 μg ／mL 和 2.144 μg ／mL 的混合对照品溶液。取样品粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入DMF 50 mL，密塞，称定质量，超声提取30 min，放冷，再称定质量，用DMF 补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方工艺制备不含青黛的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密吸取2.2 项下混合对照品贮备液 1，2，4，5，6，8，10 mL，分别置 25 mL 容量瓶中，加DMF 稀释至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。取上述溶液分别进样测定，以质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y蓝＝5.785 6 ×104X蓝－5.048 8 ×104，r ＝0.999 9（ n ＝ 7）；Y红＝ 6.365 7 × 104X红－ 6.391 × 103，r ＝ 0.999 2（n ＝7）。结果表明，靛蓝与靛玉红质量浓度分别在5.664 ～56.640 μg／mL 和 0.428 8 ～ 4.288 0 μg ／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样6 次。结果靛蓝和靛玉红峰面积的 RSD 分别为 0.35% 和 0.68% （n ＝ 6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为181217）样品，按2.2 项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，依法计算含量。结果靛蓝和靛玉红含量的 RSD 分别为 0.78% 和 1.14% （n ＝ 6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为181217）样品，依法制备供试品溶液，分别于室温下放置 0，2，4，8，12，18，24 h 时进样测定，记录色谱图。结果靛蓝和靛玉红峰面积的 RSD 分别为 1.12% 和 1.86% （n ＝ 7），表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的同一批（批号为181217）样品 0.25 g，精密称定，共 6 份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入2.2 项下混合对照品贮备液5 mL，依法制备供试品溶液。按2.1 项下色谱条件依法进样测定靛蓝和靛玉红的含量，计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝ 6）

2.4 样品含量测定

取 3 批（批号分别为 180407，181217，190112）样品，依法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，并按外标法计算样品中各成分的含量。结果3 批样品中靛蓝的含量分别为 2.81，2.78，2.89 mg ／g，靛玉红的含量分别为 0.225，0.217，0.232 mg ／g。

3 讨论

3.1 流动相选择

采用高效液相色谱法测定靛蓝和靛玉红的含量，以待测色谱峰的峰形和与其他色谱峰的分离度作为考察指标，曾考察不同流动相（甲醇－水、乙腈－水、甲醇－醋酸铵体系、乙腈－醋酸铵体系、甲醇－磷酸盐缓冲液、乙腈 －磷酸盐缓冲液），发现以甲醇 － 0.05 moL ／L 醋酸铵溶液为流动相时，可满足靛蓝与靛玉红的分离要求，且峰形好、柱效高。

3.2 样品前处理过程选择

靛蓝和靛玉红均为脂溶性成分，分别比较了甲醇、乙醇、三氯甲烷、DMF 及乙酸乙酯对样品的提取效果。结果表明，DMF 提取效率最好，最终确定以DMF 作为提取溶剂。曾考察提取方法，比较了超声提取法和回流提取法及在不同超声时间时对样品的提取效果，发现超声提取法易于操作，简便快捷，提取效果好。故最终确定以超声提取30 min 作为提取条件。

3.3 检测波长选择

通过PDA 进行全波长光谱扫描，测得靛蓝于285 nm波长处有最大吸收，靛玉红于289 nm 波长处有最大吸收，由于样品中靛蓝与靛玉红含量相差较大，靛玉红的峰面积远小于靛蓝的峰面积。故选择靛玉红的最大吸收波长289 nm 作为2 种成分的共同检测波长。

3.4 样品含量测定结果分析

2015 年版《中国药典（一部）》中规定青黛药材中靛蓝含量不得少于2.0%，靛玉红含量不得少于0.13%。按照喉康散的质量标准［1］，方中青黛药材占比为10.42%，按处方比例，计算制剂中靛蓝的理论含量应不低于 0.208% （即 2.08 mg ／g），靛玉红的含量应不低于0.013 5% （即 0.135 mg ／g）。结果表明，同一生产企业不同批号样品中靛蓝与靛玉红的含量基本一致，且含量均符合药典要求。

3.5 方法评价

本研究中建立的方法操作简便，结果准确可靠，专属性强，稳定性和重复性均较好，可用于同时测定喉康散中靛蓝和靛玉红的含量。