二十五味肺病丸改善斑马鱼微血管功能障碍及机制的探究*

强巴 ，郭胜亚 ，陈伦举 ，徐懿乔 ，李峰

（1.西藏奇正藏药股份有限公司，拉萨 850030；2.杭州环特生物科技股份有限公司，杭州 310051）

1954年第一届国际微循环会议正式提出了“微循环”这一概念[1]，是指微动脉和微静脉之间的血液循环。健全的微循环功能是机体正常运转的重要前提。微血管的结构、形态、功能和血流动力学的破坏如血栓、血管内皮受损、心输出量病理性减少等危险因素发生时，可导致微循环功能障碍，造成各器官组织营养物质和氧气供应减少，代谢废物的积累，引起细胞损伤和器官功能异常，严重者可危及生命。大量研究表明，微血管的功能异常导致的微循环功能障碍与肥胖、糖尿病、心血管疾病和神经系统疾病等密切相关[2-4]。

二十五味肺病丸是始载于《四部医典》的经典名方，其主要成分为獐牙菜、红花、檀香、牛黄、悬钩木、沙棘膏、诃子等25味药材，是传统藏药理论与现代制药技术相结合研发出的新型藏药，药物性质更加稳定，具有口服顺应性好，生物利用度高的特点。主要用于各种肺病引起的咳嗽，胸胁痛，呼吸急促，等呼吸道疾病[5-8]。有研究表明，二十五味肺病丸能够促进巨噬细胞吞噬功能、增强肠道蠕动等作用[9]。二十五味肺病丸中含有红花等具有止血、养血、促进新组织再生的成分，并且能够全面消除肺部毒素，修复呼吸道损伤，因此在肺部炎症改善方面有较好的疗效，考虑到心血管系统尤其是微循环在改善炎症和组织新生中的关键作用，推测二十五味肺病丸是否参与改善微血管功能。本研究发现，二十五味肺病丸能够增加血栓斑马鱼心输出量和血流速度，改善斑马鱼辛伐他汀诱发的微血管缺失，促进微血管再生，并且能够减少内皮细胞的损伤，降低血栓的发生率，为二十五味肺病丸的临床应用提供了药理学依据。

1 材料

1.1 动物 野生型AB品系斑马鱼，转基因血管荧光斑马鱼，以上斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中，以自然成对交配方式进行繁殖，实验动物使用许可证号为SYXK（浙）2012-0171，饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

1.2 药物与试剂 二十五味肺病丸［奇正（北京）传统藏医药外治研究院有限公司，批号160901］；花生四烯酸（上海晶纯实业有限公司，批号F1418031）；辛伐他汀（东京化成工业株式会社，批号04RUCQP）；普纳替尼（美国Med Chem Express公司，批号13771）；阿司匹林，黄芪甲苷［阿拉丁试剂（上海）有限公司，批号 G1220028，G1325036］；二甲基亚砜，邻联茴香胺（美国Sigma公司，批号D2650，D9143）。

1.3 仪器 AZ100电动聚焦连续变倍荧光显微镜（Nikon公司）；CP214精密电子天平（奥豪斯公司）；PB2084C型心跳血流分析系统SZX7（发过Viewpoint公司）；SZX7型解剖显微镜；TK-C1481EC型显微镜相连的相机（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 斑马鱼血栓模型及检测 随机选取180尾受精后3天（3dpf）的野生型AB系斑马鱼置于六孔板中（30尾/孔）。正常对照组给予溶剂对照，阳性对照组给予阿司匹林（25 mg/L）；给药组给予二十五味肺病丸27.8、83.3和250 μg/mL，其后除正常对照组外其余各组给予花生四烯酸干预1 h建立血栓模型，每组随机取10尾斑马鱼置于心跳血流分析系统下录制斑马鱼血流视频，分析统计斑马鱼心输出量（O）和血流速度（V），评价心输出量增加作用和血流速度增加作用，以心输出量和血流速度的统计学意义分别评价其对花生四烯酸诱导血栓模型斑马鱼血流动力学的改善作用。其微血管血流动力学改善作用计算公式如下：

1）对心输出量的影响：

2）对血流速度的影响：

2.2 微血管缺失模型及检测 随机选取180尾受精后24 h的转基因血管荧光斑马鱼，置于六孔板中（30尾/孔）。正常对照组给予溶剂对照，模型组给予辛伐他汀（25 mg/mL）处理后，阳性对照组给予黄芪甲苷（23.5 μg/mL），药物组给予二十五味肺病丸27.8、83.3和250 μg/mL，处理2天后，每组随机取10条斑马鱼在荧光显微镜下观察斑马鱼肠下血管、拍照并保存图片。用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼肠下血管面积（S），以肠下血管面积的统计学意义评价药物对辛伐他汀诱发的斑马鱼微血管缺失的再生作用。对斑马鱼微血管缺失的再生作用计算公式如下：

2.3 斑马鱼血管内皮损伤模型及检测 随机选取180尾5dpf转基因血管荧光斑马鱼（30尾/孔）。正常对照组给予溶剂对照，模型组给予普纳替尼处理后，阳性对照组给予阿司匹林（45 μg/mL），药物组给予二十五味肺病丸 27.8、83.3 和 250 μg/mL，24 h 后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并采集数据，拍照部位统一选取泄殖孔上方对应的三根血管，利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼体节间血管直径（D）。以体节间血管直径的统计学意义评价不同药物对普纳替尼诱发的斑马鱼血管内皮损伤的保护作用。对斑马鱼血管内皮损伤（直径减小）的保护作用计算公式如下：

用邻联茴香胺染料进行染色，每组斑马鱼在解剖显微镜下观察记录血栓发生尾数并拍照，计算各组斑马鱼血栓发生率（%），以血栓发生率评价不同药物诱发的血管内皮损伤所致血栓的保护作用。

2.4 统计学处理 采用SPSS 24.0软件进行统计学处理，数据以平均数±标准差表示，组间对比采用单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 确定斑马鱼对二十五味肺病丸的最大耐受浓度 斑马鱼血栓建模成功后[10]，给予不同浓度的二十五味肺病丸，观察斑马鱼的死亡情况。二十五味肺病丸浓度为125和250μg/mL时，斑马鱼未产生任何明显的不良反应，也未引起斑马鱼死亡，在500和1 000 μg/mL浓度下均诱发100%（30/30）斑马鱼心率和血流减慢，在1 500、2 000 μg/mL浓度下分别诱发 26.7%（8/30）和 100%（30/30）斑马鱼死亡（见表1）。因此确定血栓模型斑马鱼对二十五味肺病丸对的最大耐受浓度为250 μg/mL。

3.2 二十五味肺病丸改善斑马鱼微循环血流动力学 与正常对照组（0.36 nL/s）相比，模型对照组斑马鱼心输出量（0.11 nL/s）显著下降，提示模型建立成功。与模型对照组相比，阳性对照药阿司匹林25 μg/mL浓度组、二十五味肺病丸27.8 μg/mL浓度组斑马鱼心输出量明显增加（0.11 vs 0.30 nL/s，P<0.001；0.11 vs 0.19 nL/s，P<0.05），心输出量增加作用为76%和32%。通过进一步检测了二十五味肺病丸对血栓斑马鱼模型的血流速度的作用，与模型对照组相比，阳性对照药阿司匹林25 μg/mL浓度组、二十五味肺病丸27.8和83.3 μg/mL浓度组斑马鱼心输出量明显增加（398 vs 978 μm/s，P<0.001；398 vs 693 μm/s，P<0.001；398 vs 594 μm/s，P<0.05），血流速度增加百分比分别为74%、37%和25%，以上结果提示二十五味肺病丸能够增加血栓斑马鱼心输出量，加快血流速度，改善微循环血流动力学。见表2。

表2 二十五味肺病丸处理后斑马鱼血流动力学定量结果

3.3 二十五味肺病丸促进微血管再生 确定该模型中二十五味肺病丸的最大耐受浓度后[10]，进一步检测了二十五味肺病丸对微血管再生的影响。与正常组比较，微血管缺失模型组肠下血管面积明显减少（P<0.001）。与模型对照组相比，二十五味肺病丸浓度为 0.11 μg/mL、0.33 μg/mL 和 1 μg/mL 组斑马鱼肠下血管面积显著升高（P<0.001），对微血管再生的促进作用分别为75%、78%和91%（P<0.001，见图1、表3）。以上结果提示二十五味肺病丸能够改善微血管损伤，促进微血管的再生。

图1 二十五味肺病丸对微血管再生的促进作用表型图

3.4 二十五味肺病丸改善血管内皮损伤 确定最大耐受浓度和建模成功后[10]，进一步检测了各组斑马鱼节间血管直径和血栓形成情况。与模型组（8.7像素）相比，二十五味肺病丸0.11、0.33和1μg/mL组节间血管直径分别为10.2、11.5和11.8像素，对血管内皮的保护作用分别为29%、56%和61%（P>0.05、P<0.001、P<0.001，见表4）；同样，与模型组血栓发生率（87%）相比，浓度为 28、83和 250 μg/mL 的二十五味肺病丸斑马鱼血栓发生率分别为73%、50%和33%，与模型对照组比较，各组P>0.05、P<0.01、P<0.001（见表5）。以上结果提示二十五味肺病丸能够对斑马鱼血管内皮损伤具有保护作用。

表4 二十五味肺病丸对血管内皮的保护作用-节间血管直径

表5 二十五味肺病丸对血管内皮损伤所致血栓的保护作用

4 讨论

正常的微循环功能是保证体内重要脏器维持正常功能的重要前提，微血管的形态、结构，以及血流动力学的完整性是保障微循环功能正常的重要条件。在血管内皮细胞受损、心输出量病理性减少、血栓发生等危险因素发生时，微循环严重受损，直接危害机体健康[11-12]。大量研究表明微血管功能障碍诱发微循环功能失调，是高血压、肥胖和糖尿病及许多神经系统、心脑血管等疾病的重要发病因素[13-14]。目前关于改善微循环的药物多样，治疗效果参差不齐，不良反应明显，总体而言效果不尽人意，寻找新的靶向微循环功能改善的药物迫在眉睫[15]。

二十五味肺病丸是始载于《四部医典》的经典明方，其主要成分为獐牙菜、红花、檀香、牛黄、悬钩木、沙棘膏、诃子等25味药材，其中红花、牛黄等主要成分已经被证明能够增强心肌兴奋性、促进血液循环等改善心血管功能的效用[16]，并且二十五味肺病丸对肺部炎症有较好的疗效，局部微循环的功能和炎症改善息息相关，因此二十五味肺病丸能否改善微循环功能障碍值得探究。本研究选用了斑马鱼作为模式动物模型[17]，探讨了二十五味肺病丸在斑马鱼花生四烯酸诱导的血栓模型、普纳替尼以及辛伐他汀诱导的微血管损伤模型和血管内皮损伤模型中的作用，结果发现二十五味肺病丸首先能够改善微循环血流动力学，实验结果发现二十五味肺病丸能够增加斑马鱼25%的血流速度，最大增加32%血栓斑马鱼的心输出量，这表明二十五味肺病丸能够通过调节心肌收缩能力，促进心脏泵血，从而增加微血管血压，保障微循环充盈压，有助于改善病变局部的物质交换。炎症发生时，组织局部的脉管系统常常受损，因此微循环血管损伤的改善和血管新生在改善炎症中起到重要作用，二十五味肺病丸组斑马鱼节间血管直径明显增大，表明二十五味肺病丸能够有效地保护斑马鱼节间血管，减少血管内皮损伤，并且二十五味肺病丸斑马鱼肠下血管面积显著增加，提示二十五味肺病丸促进了斑马鱼血管的新生。因此，二十五味肺病丸能够改善微循环血流动力学，促进组织局部的物质交换，并且减少微血管内皮损伤，促进微血管新生，极大限度地保障了微血管功能的行使，进而减少血栓生成，起到改善微循环并促进其恢复功能的作用。

综上所述，二十五味肺病丸可以显著减少血管内皮损伤，促进其再生，改善微血管血流动力学作用，减少血栓生成，改善微血管功能障碍。二十五味肺病丸改善微血管功能的研究发现为其在临床上微循环功能障碍性疾病中的应用提供了药理基础，也为临床治疗微循环功能障碍提供了潜在的治疗药物。但考虑斑马鱼非哺乳动物，其具体药效和详细的分子机制有待在哺乳动物中进行进一步验证。