环介导恒温扩增法在肺结核诊断中的应用

王 欣，虞典元，胡小平，黄 晶，张 虹

（1.湖北省孝感市中心医院检验科，孝感432100；2.湖北省孝感市中心医院肾内科，孝感432100；3.江苏省苏州高新区人民医院检验科，苏州215129）

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种慢性传染性疾病。2018年全球新增确诊1 000万病例，并造成120万人死亡，我国每10万人中有61例新病例[1-2]。如果及时进行治疗，TB是可以治愈的，因此及时发现TB患者并进行治疗是控制TB传播的关键。TB的诊断包括临床评估和病原学检测[3]。痰涂片显微镜检查便宜且易于操作，但其敏感度和特异度不佳[4]；结核杆菌培养法是目前诊断TB的参考标准，但耗时长[5]；分子诊断是一种新的检测方法[3]，但有的操作繁杂，有的价格昂贵且需要较高的实验室条件。因此，急需一种简便、快速、价廉，且敏感度、特异度高的检测方法，以早期发现TB患者，达到早日治疗、控制传染源的目的。环介导恒温扩增技术（LAMP）检测与培养法相比，实验时间较短，并具有较好的敏感度与特异度，同时不需要专门的核酸扩增仪器和烦琐的实验步骤，也不需要顶尖的技术手法[6]。本研究采用痰涂片镜检法、改良罗氏培养法（L-J）、LAMP法同时对400例肺结核疑似患者的痰样本进行检测，以结核菌培养为标准，评价LAMP法对肺TB的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月至2020年1月孝感市中心医院就诊的400例肺结核可疑症状患者作为研究对象，所有患者均通过临床症状和影像学检测确定，并将痰标本送至孝感市中心医院进行基因芯片检测进行确诊。临床症状包括患者咳嗽两周或更长时间并伴有一种或多种其他症状：体质量减轻、食欲不振、盗汗、胸痛、发烧、呼吸急促、疲劳等。根据肺结核诊断标准（WS288-2017）将研究对象分为肺TB组和非肺TB组。其中肺TB组272例，非肺TB组128例。男性246例，女性154例，年龄13～81岁，平均年龄（51.2±0.32）岁。

1.2 仪器与试剂

LAMP仪（广州迪澳生物科技有限公司）。LAMP检测试剂盒（广州迪澳生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 痰结核分支杆菌涂片及镜检 痰标本采用直接涂片抗酸染色后进行显微镜检查，具体参照《中国TB防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证》[7]收集肺结核疑似患者的痰标本并进行涂片镜检。

1.3.2 L-JMTB培养 取痰标本2 mL溶于2～4 mL的4%氢氧化钠（NaOH）中（根据痰标本的浓稠度，加入4% NaOH体积为痰液的1～2倍），进行震荡摇匀消化15～20 min，使标本得到充分的液化；使用无菌吸管分别取标本沉淀2～3滴均匀接种于2管酸性培养基斜面的上、中、下部，将培养基管斜放入37℃培养箱中，于接种第3和第7天分别观察1次，以后每周观察1次，并记录相关结果，直至第8周末。

1.3.3 LAMP法检测MTB按照试剂盒说明书进行操作。同批次样品检测设置阴阳性对照及质控。样品处理：取痰标本溶于同等体积的4%NaOH中，震荡混匀后，室温静置15 min，取1 mL加入离心管中，12 000 r·min-1离心5 min后去上清；加1 mL 0.9% NaCl混匀，离心5 min后去上清；再加入100 μL DNA提取液混匀，100℃加热10 min后迅速进行冷却，离心2 min后取上清用于核酸检测。核酸扩增：于PCR反应管中加入密封液，并将2 μL模板加入到密封液液面下，瞬时离心后放入LAMP仪中，63℃扩增45 min。结果判定：扩增曲线呈S型，则为阳性，即检出MTB复合群；若扩增曲线呈直线或其他，则为阴性，未检出MTB复合群或低于检测限（1×102/mL）。

1.4 观察指标

观察LAMP法检测诊断肺结核的敏感度、特异度和准确率。采用Kappa检测法对LAMP检测与痰涂片镜检和痰液培养检查结果之间的一致性进行分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，以结核菌培养法为标准，计算LAMP检测的阳性数及阳性检出率。配对设计资料的χ2检验比较LAMP与抗酸杆菌涂片及MTB培养在检出率上的差异，各检测方法与临床诊断结果一致性采用Kappa检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般特征

本研究共纳入400例肺结核疑似患者。在开始抗结核治疗之前，收集所有患者的痰样品。在TB可疑患者中，最常见的临床表现是盗汗375例（93.75%），肺浸润279例（69.75%）和体质量减轻226例（56.5%）。

2.2 三种方法对MTB的阳性检出率比较

在400例研究对象中，LAMP法的阳性检出率［51.75%（207/400）］高于痰涂片镜检法［31.75%（127/400）］和固体培养法［40.25%（161/400）］（χ2=32.89，P＜0.001；χ2=10.65，P=0.001）。

2.3 三种方法的检测效能评价

以临床诊断和基因芯片结果为标准，LAMP法的敏感度（74.26%）高于痰涂片镜检法（46.69%）和L-J培养法（59.19%）（χ2=43.26，P＜0.001；χ2=8.88，P=0.003），见表1。

表1 三种方法检测MTB的效能比较

2.4 L-J培养法和LAMP法在痰涂片镜检阴性患者中检测MTB的效能比较

在273例痰涂片镜检阴性患者中，L-J培养法和LAMP法的阳性检出率分别为16.11%（44/273）、30.03%（82/273），LAMP法高于L-J培养法（χ2=43.31，P＜0.001）。以临床诊断结果为标准，LAMP法的敏感度为56.55%（82/145），L-J培养法的敏感度为30.34%（44/145），LAMP法敏感度高于L-J培养法（χ2=86.78，P＜0.001），见表2。

表2 L-J培养法和LAMP法在痰涂片阴性患者中检测MTB的效能比较

2.5 LAMP法在痰涂片镜检及L-J培养阴性患者中检测MTB的效能评价

在229例痰涂片镜检及L-J培养阴性患者中，LAMP的阳性检出率为19.65%（45/229）。以临床诊断结果为标准，LAMP法检测MTB的敏感度和特异度分别为44.55%（45/101）、96.09%（123/128），见表3。

表3 LAMP法在痰涂片镜检及L-J培养阴性患者中检测MTB的效能

3 讨论

快速及时诊断TB，对有效治疗疾病和预防感染扩散至关重要。目前，TB的诊断主要依赖于痰涂片抗酸染色镜检及结核杆菌固体培养[8]，由于敏感度较低、检测周期长等缺点，不利于治疗方案的制定和实施，涂片阴性者在等待报道期间，临床医师仅能经验性用药，进而可能延误最佳治疗时机，不利于预后康复[9-10]。快速分子诊断方法可以显著地筛查漏诊病例从而达到及早治疗和控制感染的目的[11]。但是，当前分子诊断方法的实用性受到其成本和操作复杂性的限制。LAMP法是一种快速检测MTB的分子诊断技术，不需要专有设备，可迅速检测标本中是否存在MTB[12-13]。

本研究将临床诊断结果作为参考方法，将LAMP法与痰涂片镜检法及L-J培养法进行了比较。发现LAMP法对肺结核患者痰标本的阳性检出率、敏感度及特异度均高于痰涂片镜检法和L-J培养法。LAMP诊断肺结核的敏感度为74.26%，特异度为96.09%，高于痰涂片镜检法和L-J培养法，与Gelaw等[5]报道的结果相当（敏感度75%，特异度98%），提示LAMP法的临床应用价值高于痰涂片镜检法和L-J培养法。与Bojang等[14]报道的LAMP法特异度（94%）相比，本研究的LAMP分析的特异度（96.09%）更高，但其发现LAMP法具有更高的敏感度（99%）。

在痰涂片镜检阴性患者中，LAMP法检测的敏感度为56.55%，高于L-J培养法30.34%，LAMP法检测结果与临床诊断结果具有中度一致性（Kappa=0.51）；在痰涂片镜检和L-J培养阴性患者中，LAMP法检测MTB的敏感度为44.55%，与临床诊断结果相比具有中等一致性（Kappa=0.43）。LAMP法在痰涂片镜检阴性患者中的阳性检出率为30.03%，在痰涂片镜检和L-J培养结果均阴性的患者中的阳性检出率为19.65%，孙娇等[15]发现在痰涂片镜检和L-J培养均阴性标本中，LAMP法的阳性检出率为20%～30%，本研究的结果与其相一致。提示LAMP法对于检测痰涂片镜检和L-J培养阴性肺结核患者具有一定的优势。

本研究中LAMP法与L-J培养结果存在不一致的情况：L-J培养未检出而LAMP检出有53例，原因可能是L-J培养法需对痰标本进行消化等前处理工作，若消化液使用过多或消化时间过长，可能会使MTB失活甚至死亡，从而无法培养出阳性菌落；另外LAMP法检测的是MTB的核酸，无论细菌是否有活性，均可被检出，而L-J培养法只可以检测出活的MTB[16]。LAMP检测阴性而L-J培养检测阳性7例可能原因分析如下：LAMP的取样量少，为60 μL，取样部位及取样量均可影响检测结果[17]。

综上所述，LAMP法对肺结核患者痰标本的阳性检出率及敏感度及特异度均高于痰涂片镜检法和L-J培养法，LAMP在结核感染及涂阴肺结核中均具有较高的诊断效能，对临床结核感染早期快速诊断尤其是涂片检查阴性者有较高的应用价值，且具有耗时短、操作简单、检测成本低的特点，值得临床推广和借鉴。