miR-21拮抗剂、左炔诺孕酮对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、凋亡的影响

马 钊，田春花，杨梅芳，吴 阳，金 秋，马鸿云

（1.宁夏回族自治区人民医院，西北民族大学第一附属医院，北方民族大学合作办学医院，银川750002；2.宁夏回族自治区银川市妇幼保健院，银川750002）

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是女性生殖系统恶性肿瘤之一，发病率、病死率居女性恶性肿瘤首位，且呈年轻化趋势，约14%的患者发病时处于育龄期，其中约70%的患者仍有生育意愿[1-4]。以孕激素为基础的保育治疗方案为年轻且有生育要求的EC患者提供了临床选择[5-7]。但约有30%的患者对孕激素治疗产生耐药，这与孕激素激活磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路产生孕激素抵抗有关[8-9]，也为年轻早期EC患者保留生育功能治疗带来困难[10]。研究[11-13]发现，微小RNA（miRNA）参与EC的发生、发展。韩振坤等[14]发现，在EC组织中miR-21呈高表达，且与癌组织的恶性程度呈正相关，这与Lai、王淑芳等[15-16]研究结果一致。因此推测，拮抗miR-21表达可能具有抑癌作用。文章旨在探究miR-21拮抗剂联合左炔诺酮对EC Ishikawa细胞增殖与凋亡的影响，为年轻早期EC患者制订保留生育功能治疗的新方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

本实验使用人EC细胞株Ishikawa，细胞株购买自北纳生物公司（BNCC338359）。

1.2 试剂与仪器

完全DMEM培养基（KGM12800S-500，凯基生物）；Lipofectamine ? 3000 Transfection Reagent（L3000015，invitrogenTM）；miR-21拮抗剂（中洪博元分子实验室提供）；左炔诺孕酮（LNG）（S1727，Selleckchem）：50 mg HCY干粉中加入1.6 mL DMSO溶解，得100 mmol·L-1母液，-20℃分装保存，根据实验需求剂量进行稀释；CCK-8法细胞增殖检测试剂（KGA317，凯基生物）；Anti-PTEN antibody［EPR9941-2］（ab170941，Abcam）；辣根酶标记二抗［山羊抗兔IgG（H+L）（亲和纯化）（ZB-2301）中杉金桥］；DAB显色试剂盒（CW0125，CWBIO康为世纪）；中性树脂（CW0136，CWBIO康为世纪）；苏木素染色（AR1180-1，博德生物）；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（AP101-100-kit，MULTI SCIENCES联科生物）；结晶紫染色液（G1061，Solarbio）；miRNA cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒（CW2141S，CWBIO康为世纪）；miRNA qPCR Assay Kit（CW2142S，CWBIO康为世纪）；miRNA Purification Kit提取试剂盒（CW0627S，CWBIO康为世纪）；Trizon Reagent（CW0580S，CWBIO康为世纪）；Ultrapure RNA超纯RNA提取试剂盒（CW0581M，CWBIO康为世纪）；HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒（CW2569M，CWBIO康为世纪）；UltraSYBR Mixture（CW0957M，CWBIO康为世纪）；RIPA细胞裂解液（C1053，北京普利莱基因技术有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（BCA Protein Assay Kit）（CW0014S，康为世纪）；内参一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（TA-08，中杉金桥，1/2 000）；二抗：辣根酶标记山羊抗鼠IgG（H+L）（ZB-2305，中杉金桥，1/2 000）；目的一抗：Rabbit Polyclonal Anti-AKT（ab8805，Abcam，1/500）；目的一抗：Rabbit Polyclonal Anti-P-AKT（bs-2720R，Bioss，1/500）；目的一抗：Rabbit Polyclonal Anti-PI3K（bs-0128R，Bioss，1/500）；目的一抗：Rabbit Polyclonal Anti-P-PI3K（AF3241，Affinity，1/1 000）；二抗：辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（ZB-2301，中杉金桥，1/2 000）；倒置荧光显微镜（MF53，广州市明美光电有限公司）；多功能酶标分析仪（SAFIREII，TECAN瑞士帝肯）；离心机（TD4A，长沙英泰仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-1600PC，上海美谱达仪器有限公司）；蛋白垂直电泳仪（DYY-6C，北京市六一仪器厂）；超高灵敏度化学发光成像系统［Chemi DocTMXRS+，伯乐生命医学产品（上海）有限公司］；EDTA胰蛋白酶消化液（T1300 Solarbio）；离心机（型号：TGL-16D，常州中捷实验仪器制造有限公司）；Annexin V-FITC（AP101-100-kit，MULTI SCIENCES联科生物）；十二烷基苯磺酸钠凝胶（151-21-3，西陇科学股份有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养、分组和转染 采用完全DMEM培养基在湿度饱和37℃、5% CO2常规条件的二氧化碳细胞培养箱中培养Ishikawa细胞。实验分为Ishikawa组（Control组）；Ishikawa+LNG处理组（LNG组）；Ishikawa+LNG+miR-21拮抗剂处理组（LNG+miR-21组）；Ishikawa+LNG+miR-21无关序列处理组（LNG+NC组）。每组设置3个复孔。将对数生长期的Ishikawa细胞以106个/孔接种至6孔细胞板上，待细胞汇合达80%时转染，前一天接种或换液，取出RNA干粉离心3 000 r·min-1，5 min；使用Opti-MEMR培养基稀释LipofectamineR 3000试剂充分混匀，避光室温孵育5 min。在每管已稀释的Lipofectamine R 3000试剂中加入稀释的RNA中混匀，室温避光孵育1 h。按照上述分组，加入RNA-脂质体复合物至细胞中。37℃、5%CO2培养箱孵育细胞，转染48 h后收集各组细胞进行后续实验。

1.3.2 流式细胞仪检测Ishikawa细胞凋亡 弃Ishikawa细胞株上清液，每孔1 mL PBS润洗2遍，加200 μL含螯合剂（EDTA）胰蛋白酶消化液，放入37℃培养箱，当Ishikawa细胞消化后，用含血清的完全培养基终止子宫内膜细胞消化、吹散后收集Ishikawa细胞悬液。将Ishikawa细胞悬液在2 500 r·min-1离心3 min并弃上清液。加1 mL PBS后再2 500 r·min-1，离心3 min后弃Ishikawa细胞上清液，每管加PBS 300 μL混匀后再加5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶（PI），轻混匀后，待室温避光孵育10 min后上机。

1.3.3 CCK-8检测Ishikawa细胞增殖 将Ishikawa细胞消化、重悬、计数、铺96孔板（细胞密度为5×103个/孔），待EC细胞贴壁后，按照分组进行相应处理，处理24 h向待测板中每孔加入10 μL CCK-8反应2 h，分别采用酶标仪在波长450 nm吸光处检测并计算细胞的存活率。细胞存活率（%）=［A（实验组）-A（空白培养基）］/［A（对照组）-A（空白培养基）］×100%[17]。

1.3.4 Transwell实验检测Ishikawa细胞侵袭力 将Ishikawa细胞消化收集后离心，用无血清培养基重悬细胞并且计数，使每个小室细胞数为3×104个；在小室加入500 μL完全培养基，上室细胞与无血清培养基总体积约300 μL；48 h后进行结晶紫染色。去除各孔中的培养基，然后加入PBS清洗5 min，加配好的0.1%结晶紫染色1 h，染完后擦去小室的内室细胞，之后将小室倒置拍照，拍照完成后去除孔中的染色液，在每个孔中加入配制好的33%乙酸（取33 mL 100%乙酸加到67 mL纯水中，混匀）2 mL溶解细胞中的染液，充分混匀静置后，用分光光度计，以波长为570 nm，用33%乙酸调零，测定每孔中的溶液的吸光值，平行3次。

1.3.5 划痕实验检测Ishikawa细胞迁移力 待Ishikawa细胞铺板密度达到90%以上后进行细胞划痕，使用200 μL枪头在每孔进行划痕，弃去培养基，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗3次，换成无血清培养基后给每孔划痕拍照；将细胞放入培养箱中，24 h后再次给每孔的划痕拍照。测量细胞划痕宽度，进而计算出细胞的迁移速率，细胞迁移率=（0 h划痕宽度-培养后划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%[18]。

1.3.6 Western blot检测各组PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白表达Ishikawa细胞中加入裂解液，裂解30 min后，4℃下10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清，可得总蛋白。根据蛋白浓度测定试剂盒（BCA）测定蛋白浓度。蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2 h，后湿法转膜30～50 min。一抗溶液孵育，4℃过夜；二抗溶液室温孵育1～2 h。在膜上滴加超敏化学发光液（ECL）曝光液后，在凝胶成像系统中曝光。用Quantity one软件分析各抗体条带灰度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有实验重复3次，计量资料采用均数±标准差（±s）表示。两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 确定LNG最佳作用浓度和时间

在LNG作用24 h，细胞凋亡率随着浓度增加升高（P＜0.05），尤其100 μmol·L-1浓度凋亡率最高。并且细胞在10、50和100 μmol·L-1浓度时存活率均降低（P均＜0.05），尤其100 μmol·L-1浓度凋亡率最高、存活率最低。因此以下实验选择LNG的浓度为100 μmol·L-1，作用时间为24 h，见图1。

图1 确定LNG最佳作用浓度和时间

2.2 各组细胞凋亡率、侵袭力、迁移力及增殖率比较

与Control组相比，LNG+NC组和LNG+miRNA-21组的凋亡率均升高（P均＜0.05）；与Control组相比，LNG+miRNA-21组的侵袭和迁移能力均降低（P均＜0.05）；LNG、LNG+NC组和LNG+miRNA-21组的增殖能力均降低（P均＜0.05），见图2。

图2 不同处理方法对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响

2.3 PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达

与Control组相比，LNG组和LNG+miR-21组PTEN、AKT、PI3K蛋白表达升高，p-AKT、p-PI3K蛋白表达均降低（P均＜0.05）；与Control组相比，LNG+NC组PTEN、AKT、PI3K蛋白表达升高，p-AKT、p-PI3K基因表达降低（P均＜0.05），见图3、图4。

图3 聚丙烯酰胺凝胶电泳图

图4 PTEN、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K蛋白在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达

3 讨论

单独应用孕激素或联合宫腔镜病灶切除是年轻早期EC患者最常用、最有效的保留生育能力的治疗方案[1，4-5，19]。但是长期使用孕激素治疗可以导致ECPR表达下降，即产生耐药性；有研究发现，在PR阴性表达或低表达EC细胞中，孕激素可激活PI3K/AKT通路产生孕激素抵抗[8]，从而使患者对孕激素治疗不敏感，这为年轻患者保留生育功能临床治疗带来巨大困难[10]。针对孕激素抵抗机制的靶向治疗可能逆转孕激素抵抗，应用孕激素联合靶向治疗可能成为有生育要求的EC患者治疗的新手段。

miRNA属于内源性非编码小分子RNA，其可通过5’-种子区与调控一个或多个靶基因miRNA的3’-非翻译区（untranslated region，UTR）碱基互补配对来调控靶基因表达，从而起到类似抑癌或促癌基因的作用[20-21]。有学者发现EC细胞内存在多种miRNA表达异常，这提示miRNA可能参与了EC的发生与发展[11-12]。miR-21是miRNA的一种，在EC患者血清、癌组织中均见miR-21高表达，且其表达的程度与淋巴转移、不良预后密切相关[15]，这提示miR-21可能参与了EC的发生、发展。Gao、秦晓燕等[22-23]的研究证实了上述观点。这为临床上子宫内膜癌的基因治疗提供依据。

目前学者公认的PTEN可以抑制EC的发生、发展，多数EC的发生与PTEN功能的缺失有关[24]，在最常见的EC亚型中，80%的EC都有PTEN突变[25]。miR-21在EC中过表达，miR-21可以下调PTEN的表达水平，从而促进EC的细胞增殖[26]。

本研究结果显示，与其他组相比，LNG+miR-21组采用100 μmol·L-1LNG联合miR-21拮抗剂处理EC Ishikawa细胞，其增殖率、迁移和侵袭能力最低，而细胞凋亡率最高。这说明LNG联合miR-21拮抗剂可以抑制EC Ishikawa细胞增殖，促进其凋亡；与其他组相比，LNG+miR-21组EC Ishikawa细胞的PTEN、AKT、PI3K蛋白表达最高，而p-AKT、p-PI3K蛋白表达最低，这说明miR-21拮抗剂通过上调PTEN蛋白表达，来抑制PI3K/AKT通路，增强LNG的抗癌作用，从而实现抑制Ishikawa细胞增殖、迁移及侵袭作用，最终促进Ishikawa细胞凋亡。

综上所述，miR-21拮抗剂联合左炔诺孕酮可以促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的凋亡，抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖，这为年轻早期EC患者的临床治疗提供了新的思路。