CT-707对缺氧微环境下肝癌细胞能量代谢和细胞周期的影响及作用机制

姚红兵 吴嘉兴 郭 威 文雪霖 蒋建晖 刘翔峰

肝细胞癌(肝癌)是常见的恶性肿瘤，缺氧是恶性肿瘤微环境的主要特征之一，肝癌细胞在缺氧环境下可通过增强糖酵解代谢方式，维持细胞增殖的能量需求，从而促进肝癌进程[1,2]。糖原合成激酶(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)介导的信号通路对细胞的增殖、分化及能量代谢具有重要作用，其活性受到Akt的调控。黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一种胞质非受体蛋白酪氨酸激酶，与肿瘤的多种生物学行为密切相关，磷酸化的FAK可通过结合PI3K/Akt促进癌细胞的增殖[3]。研究发现，FAK在肝癌组织中异常表达及活化，并与肝癌进展有显著相关性，可作为肝癌药物开发的新靶标[4]。多激酶抑制剂CT-707是一种新型FAK抑制剂，可通过抑制FAK的磷酸化发挥良好的抗肿瘤活性[5]。笔者前期研究已证实CT-707在肝癌动物模型中可抑制肝癌细胞的增殖以及肿瘤形成，促进癌细胞的凋亡[6]。故本研究结合肝癌细胞在缺氧微环境中的代谢特点，基于PI3K/Akt/GSK-3β信号通路，旨在进一步探讨新型FAK抑制剂CT-707的抗肝癌作用及机制。

材料与方法

1.试验材料：人肝癌HepG2细胞株购自中国科学院上海细胞库，使用含10%胎牛血清及1%双抗的改良Eagle培养基(DMEM)培养基，于5%CO2、37℃培养箱中常规培养。6周龄BALB/c裸鼠购自广西医科大学实验动物中心，在SPF级条件下饲养。CT-707购自美国MCE公司；DMEM、胎牛血清购自美国Gibco公司；cyclin D1、cyclin E、p-FAK、FAK、PI3K、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β、PCNA、β-actin抗体购自英国Abcam公司；p-PI3K、p-Akt抗体购自美国CST公司；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗购自美国Sigma公司；HE染色试剂盒、己糖激酶(HK)试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自北京Solarbio公司；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成生物；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物公司。

2.HepG2缺氧培养及分组：将HepG2细胞接种于6孔板中，每孔细胞数2×105，参照文献[5,7]按CT-707剂量范围(0～6μmol/L)分为control(对照)组以及处理组[CT-707高(6μmol/L)、中(3μmol/L)、低(1.5μmol/L)剂量组]。根据实验分组，处理组分别加入相应剂量的含药DMEM，对照组则加入无药DMEM，各组均于37℃缺氧培养箱(2%O2、5%CO2、93%N2)中培养48h。

3.CCK8：将对数生长期的HepG2接种于96孔板中，根据分组进行相应处理，并设置空白对照(空白组)，培养48h后，每孔加入10μl CCK8工作液，37℃培养2h，酶标仪检测450nm波长处的吸光度(A)值，计算细胞存活率：细胞活性(%)=(A处理组-A空白组) /(A对照组-A空白组)×100%。

4.HK酶活性检测：收集各组细胞，培养基稀释为5×106/ml，加入1ml提取液，冰浴超声提取，重复操作多次使细胞充分破碎，8000×g4℃离心10min，取上清待测。取50μl待测液于EP管中，加入950μl工作液，混匀后快速移至微量石英比色皿中，紫外分光光度仪测定340nm波长下吸光度A1。将反应液置于37℃中水浴2min，立即测定吸光度A2。计算HK酶活[U/(gpro)]=(A2-A1)/毫摩尔消光系数/反应时间/比色光径×(反应液总体积/取样量)×1000。

5.LDH含量检测：胰酶消化收集各组HepG2，进行计数，离心弃上清，按5×106个细胞加入1ml提取液的比例加入提取液，冰浴超声波提取2min，8000×g4℃离心10min，根据LDH试剂盒试剂盒说明书配置标准品和样品，按步骤加入样本和基质缓冲液、辅酶Ⅰ，37℃反应15min，加入2，4-二硝基苯肼，漩涡混匀，37℃孵育15min，加入NaOH溶液室温放置3min，440nm波长，1cm光径比色，按标准曲线计算LDH含量。

6.Western blot法检测：各组HepG2用预冷的PBS洗涤2次，RIPA裂解液冰上裂解30min，低温离心取上清，行BCA蛋白定量。每孔蛋白上样量为20μg，SDS-PAGE电泳，湿法转膜。5%脱脂牛奶室温封闭1h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次。二抗室温孵育1h，洗膜3次，用ECL检测液发光显影定影后，Image J分析灰度值。

7.裸鼠皮下成瘤及药物治疗：将对数生长期的HepG2胰酶消化收集，1000×g离心5min，取细胞沉淀重悬，制成细胞浓度为2.5×107/ml悬液。于无菌环境下，采用1ml注射器抽取0.2ml细胞悬液，在常规消毒的裸鼠腋部皮肤进行细胞悬液接种。根据实验动物3R原则，将接种HepG2细胞悬液的裸鼠随机分为4组，分为模型组和CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)剂量组，每组8只，CT-707按照剂量腹腔注射给药，每天两次，模型组则注射等量0.9%氯化钠溶液[7]。给药14天后处死动物，取肿瘤组织进行称重及体积测量。

8.HE染色：肿瘤组织于4%多聚甲醛中固定，行石蜡切片，根据HE试剂盒说明进行染色，封片，镜检，观察组织病理结构。

9.免疫组化：取各组肿瘤组织切片进行免疫组化染色。采用微波抗原修复后，滴加3% H2O2以去除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水洗净。滴加封闭液室温孵育，一抗4℃过夜孵育。弃去一抗，PBS冲洗，滴加二抗，室温孵育20min，弃去二抗。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育20min，PBS洗净后滴加DAB显色。着色后浸入水中终止反应，自来水反复冲洗后，苏木精复染；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察并拍照。Image J软件分析PCNA的阳性表达。

结 果

1.缺氧环境下CT-707对肝癌细胞活性、能量代谢及细胞周期的影响：与对照组比较，CT-707高、中、低剂量组HepG2细胞活性下降，HK活性及LDH含量显著下调，细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E显著下调(P<0.05)，中、高剂量组的效应明显优于低剂量组(P<0.05)，中、高剂量组间结果比较，差异无统计学意义(P<0.05，图1、图2)。

图1 各组细胞活性、HK活性及LDH含量检测结果A.细胞活性；B.HK活性；C.LDH含量。与对照组比较，*P<0.05；与CT-707(1.5μmol/L) 组比较，#P<0.05

图2 各组细胞中cyclin D1和cyclin E的蛋白表达与对照组比较，*P<0.05；与CT-707(1.5μmol/L) 组比较，#P<0.05

2.缺氧环境下CT-707对FAK/PI3K信号通路的影响：与对照组比较，CT-707高、中、低剂量组HepG2中FAK、PI3K、GSK-3β、p-FAK/FAK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β水平均明显下调，中、高剂量组的效应明显优于低剂量组(P<0.05)，中、高剂量组间结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，各组Akt蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05，图3)。

图3 FAK/PI3K信号通路关键因子的Western blot法检测结果

3.CT-707对HepG2裸鼠移植瘤的抑制作用：与模型组比较，CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)剂量组瘤质量、瘤体积明显下降(P<0.05)，其中中、高剂量组的效应明显优于低剂量组(P<0.05)，中、高剂量组间结果比较，差异无统计学意义(P>0.05，图4)。

图4 裸鼠移植瘤质量和体积A.移植瘤质量；B.移植瘤体积；与模型组比较, *P<0.05; 与CT-707(25 mg/kg) 组比较, #P<0.05

4.CT-707对HepG2裸鼠移植瘤细胞增殖及坏死的影响：采用HE染色检测HepG2裸鼠移植瘤细胞坏死情况。镜下观察模型组细胞核清晰可见，细胞排列整齐致密；CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)剂量组细胞排列松散，部分细胞核消失，出现坏死区域，且随着CT-707剂量增加，坏死区域增加，细胞核消失增加。采用免疫组化检测HepG2裸鼠移植瘤中PCNA的表达情况，结果表明，与模型组比较，CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)剂量组PCNA阳性细胞表达率均显著降低(P<0.05)，中、高剂量组的效应明显优于低剂量组(P<0.05)，中、高剂量组间结果比较，差异无统计学意义(P>0.05，图5、图6)。

图5 各组移植瘤的HE染色比较(×400)A.模型组；B.CT707(25mg/kg)组；C.CT707(50mg/kg)组；D.CT707(100mg/kg)组

图6 各组移植瘤中PCNA的阳性表达比较(×400)与模型组比较, *P<0.05; 与CT-707(25mg/kg) 组比较, #P<0.05

讨 论

肝癌发病隐匿且病情进展迅速，患者确诊时大多已在进展期或晚期。肝癌细胞的快速增殖，是导致肝癌病情进展迅速的重要原因[8]。恶性肿瘤增殖过程伴随高速代谢，在快速生长的同时，氧耗剧增，且肿瘤内新生血管滞后引起血氧供应不足，从而造成肿瘤组织局部缺氧，此时癌细胞可通过增强糖酵解，并转而依赖糖酵解途径作为主要能量供给来源，适应缺氧微环境。肿瘤在缺氧微环境中的持续增殖，是多种蛋白作用的结果，其中缺氧可诱导FAK激活，FAK可通过PI3K/Akt等多条信号通路参与增殖和肿瘤的形成[9]。CT-707是一种新型多激酶抑制剂，可抑制FAK、ALK和Ply2蛋白的活性，研究表明，CT-707在缺氧环境下对HepG2具有更强的增殖抑制效果，但其作用机制尚未完全阐明[7]。因此，本研究通过建立HepG2缺氧模型及皮下成瘤动物模型，进一步观察CT-707对HepG2糖酵解途径及细胞周期的影响，探讨其抗肝癌细胞增殖的作用机制。

糖酵解代谢模式为癌细胞的增殖提供了物质基础，使得癌细胞在缺氧等环境中存活和增殖[10]。HK是糖酵解途径的关键酶，可将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，在缺氧条件下为癌细胞提供碳源，HK在包括肝癌在内的癌组织中大量表达，可促进癌细胞的增殖及糖酵解[11]。LDH是催化糖酵解的限速酶之一，可将丙酮酸转化为乳酸排至胞外。LDH在多种肿瘤组织中表达升高，其表达与肿瘤组织的大小显著相关，可作为肿瘤诊断的标志物[12]。此外，癌细胞通过调控细胞周期的时相分布从而实现快速增殖。细胞周期蛋白的表达和调控，是控制细胞周期转换，影响增殖的关键因素。

细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E可引起DNA复制，推动细胞周期由G1期进入S期，从而促进癌细胞的增殖[13]。本研究发现，CT-707在缺氧培养条件下抑制HepG2细胞增殖的同时，可降低HK和LDH的含量，抑制cyclin D1、cyclin E的表达，表明CT-707可阻断缺氧环境下肝癌细胞糖酵解代谢途径，并诱导细胞周期阻滞，具有显著的抗肝癌细胞增殖的效应。

cyclin D1、cyclin E及HK、LDH的表达受GSK-3β的调控[14, 15]。GSK-3β通过介导细胞内多种信号转导通路，磷酸化使底物蛋白失活发挥负性调节作用，是细胞内糖代谢、细胞增殖、分化及凋亡调控的关键因子[16]。研究发现，GSK-3β在肝癌组织中的表达水平低于正常肝组织及癌旁组织，其表达与组织病理学评分、肿瘤分级相关[17]。PI3K/Akt是GSK-3β上游信号通路，Akt可磷酸化GSK-3β Ser9位点，抑制GSK-3β的活性，促进糖酵解及细胞周期蛋白的表达，进而促进癌细胞的增殖[18]。抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路是多种药物的抗肿瘤作用机制，而FAK可参与调控PI3K/Akt信号通路，因此推测FAK抑制剂CT-707可通过抑制PI3K/Akt/GSK-3β发挥抗肝癌作用。本研究发现CT-707可显著下调缺氧培养下HepG2中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK-3β/ GSK-3β表达水平，且CT-707中、高浓度时作用更明显，表明CT-707抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路可能是其抑制肝癌细胞增殖的关键机制。

为进一步研究CT-707对肝癌细胞增殖的影响及机制，本研究对皮下种植HepG2的裸鼠给予CT-707治疗，发现CT-707可显著减小移植瘤的体积和质量，破坏癌组织结构，表明CT-707具有显著的抗肝癌作用。PCNA是DNA复制的必须物质，与细胞中DNA合成及细胞周期密切相关。PCNA的表达从G1期开始升高，S期表达达到高峰，到G2期逐渐下降，是反映细胞增殖的主要生物学指标[19]。本研究发现,CT-707可显著下调PCNA阳性细胞比例，进一步从体内研究证实CT-707可引起肝癌细胞周期阻滞，抑制细胞增殖活性，从而发挥抗肝癌作用。

综上所述，本研究发现FAK抑制剂CT-707在缺氧环境下可通过抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路，阻断肝癌细胞糖酵解代谢途径，并诱导细胞周期阻滞，抑制肝癌细胞增殖及肿瘤生长，表明CT-707作为一种FAK靶向抑制剂具有良好的抑癌作用，可能是潜在的肿瘤靶向药物，值得深入研究。