苦参碱通过PTEN/PI3K/Akt通路调控非小细胞肺癌上皮间质转化并影响细胞迁移和侵袭

俞森权 胡佳丽 高文仓

肺癌在全球范围内是发生率和病死率最高的恶性肿瘤，并且近年来其发生率仍在不断上升[1]。肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中后者占大多数[2]。据统计很多患者在晚期阶段才被确诊，因此错过了疾病的最佳治疗时间[3]。尽管现有的治疗方法多样，但非小细胞肺癌患者的预后较差，生存率仍较低，5年生存率为30%左右[4]。因此，寻找有效的药物和治疗手段对降低非小细胞肺癌病死率，提高预后生存率至关重要。

中医药防治肿瘤有数千年历史，能够在干预癌前病变、预防转移复发、带瘤生存等方面发挥重要作用[5, 6]。已有研究发现，肿瘤患者若能够配合正规的中医药进行稳定长期治疗，生活质量和存活时间得到显著改善[7]。中药能够通过多种机制抗肿瘤，如抑制肿瘤细胞增殖，促进凋亡，逆转药物耐药等[8]。

苦参碱是中草药苦参活性成分的提取物质，为四环噻嗪啶类化合物，属于生物碱类物质[9]。有研究证明苦参素在多种癌症治疗中发挥作用，如肝癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等[10～12]。苦参碱能够促进抗肿瘤免疫反应、诱导多种肿瘤细胞凋亡和自噬、抑制肿瘤细胞浸润转移、逆转肿瘤细胞耐药性等[13]。本研究探讨了苦参碱在非小细胞肺癌中对肿瘤生长和转移侵袭的影响及其分子机制，为非小细胞肺癌的中药治疗及其相关研究提供了理论基础和科学依据。

材料与方法

1.人肺癌细胞培养：从中国科学院购入人肺癌细胞株A549和H1650(上海生命科学研究院细胞库)。使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基(美国赛默飞世尔科技公司)按照常规方法培养细胞，隔天换液，长满时进行传代。取处于对数生长期的A549和H1650细胞进行实验。

2.非小细胞肺癌小鼠模型构建:本实验所用BALB/c裸鼠来自杭州医学院实验动物中心。本实验操作通过浙江省实验动物中心实验动物福利伦理学委员会审核(伦理学审批号：ZJCLA-IACUC-20020019)。首先制备了浓度为1×106个/毫升的A549单细胞悬液，皮下注射于裸鼠右侧腋下，饲养10天。待造模成功后，随机分为对照组和实验组，每组6只。实验组小鼠将苦参碱溶液按75mg/kg进行连续腹腔注射2周。对照组小鼠注射10ml/kg 0.9%氯化钠注射液。小鼠处死后，剥离肿块，测量体积及重量并采集图片。每次测量重复3次以上。

3.MTT比色法:将A549和H1650接种至96孔板中，使用不同浓度(0.5、1.0、2.0mg/ml)苦参碱进行孵育。MTT法检测细胞活力改变，每孔添加5mg/ml MTT溶液(美国赛默飞世尔科技公司)20μl，继续孵育4h后去上清液。使用酶联免疫检测仪于490nm处检测吸光度(A)值。

4.AnnexinV/PI染色:1.0mg/ml苦参碱处理A549和H1650后，收集细胞。先后加入Annexin V-FITC和PI(美国赛默飞世尔科技公司)进行避光孵育，流式细胞仪检测凋亡细胞。

5.划痕实验：待A549和H1650细胞密度饱和，垂直平板划痕，PBS洗涤脱落的细胞。加入1.0mg/ml苦参碱培养48h后，倒置显微镜下观察并计算细胞迁移距离。

6.Transwell实验：在涂有Matrigel胶的Transwell小室上室中加入细胞悬液，下室中则加入含药高浓度血清培养基。48h后，取出Transwell小室，使用甲醛固定细胞，结晶紫进行染色。PBS洗涤2遍，在倒置显微镜下进行细胞计数。

7.Western blot法检测：提取A549、H1650和肿瘤组织的总蛋白。12%SDS-PAGE分离蛋白质，然后电转至 PVDF膜(美国赛默飞世尔科技公司)。5%脱脂牛奶进行膜封闭，随后选用一级抗体在4冰箱摇床孵育。次日，HRP标记二抗孵育，用ECL试剂盒检测信号。一级抗体购自美国Cell Signaling Technology公司：Bax(1∶1000，#5023)、Bcl-2(1∶1000，#15071)、E-cadherin(1∶1000，#3195)、N-cadherin(1∶1000，#13116)、vimentin(1∶1000，#5741)、Snail(1∶1000，#3879)、PTEN(1∶1000，#9188)、p-Akt(1∶1000，#4060)、Akt(1∶1000，#4685)。

结 果

1.苦参碱降低了人肺癌细胞A549和H1650的细胞活性：本研究将人肺癌细胞A549和H1650作为体外细胞模型。用0.5、1.0、2.0mg/ml浓度的苦参碱处理细胞后，MTT 结果发现细胞活性伴随着苦参碱浓度不断升高而显著降低，细胞增殖被抑制(图1A)。AnnexinV/PI染色和Western blot法检测结果表明，苦参碱诱导细胞凋亡，细胞凋亡率不断升高，促凋亡蛋白Bax表达上调以及抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(图1)。同时，研究发现，当苦参碱处理浓度为1.0和2.0mg/ml时，细胞活性没有很显著差异，因此选取1.0mg/ml作为后续研究浓度。

图1 苦参碱对细胞活性和细胞凋亡的影响A.MTT检测细胞活性; B.Annexin V/PI染色结果; C.Western blot法检测凋亡相关蛋白表达。与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01, ***P=0.000

2.苦参碱抑制A549和H1650的细胞迁移和侵袭：本研究中，苦参碱(1.0mg/ml)处理A549和H1650细胞48h后，划痕实验显示苦参碱处理后，细胞运动距离变短，迁移能力减弱(图2A)；Transwell实验表明细胞侵袭能力也随之减弱(图2B)。

图2 苦参碱抑制细胞迁移和侵袭A.划痕实验表明苦参碱减弱细胞迁移能力; B.Transwell实验表明苦参碱减弱细胞侵袭能力(结晶紫染色，×100)

3.苦参碱抑制A549和H1650的上皮间质转化(EMT)过程:苦参碱(1.0mg/ml)处理A549和H1650细胞48h后，应用Western blot法检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Snail表达(图3)，结果表明，E-cadherin表达显著上调，N-cadherin、vimentin和Snail表达显著下调。

图3 Western blot法检测EMT相关蛋白表达

4.苦参碱调控PTEN/PI3K/Akt通路：本研究用苦参碱(1.0mg/ml)处理A549和H1650细胞48h后，Western blot法和qRT-PCR检测相关蛋白PTEN，p-Akt和Akt表达(图4)。

图4 Western blot法检测PTEN/PI3K/Akt通路相关蛋白

5.体内实验研究苦参碱对非小细胞肺癌的影响：本研究成功构建了非小细胞肺癌小鼠模型，并用苦参碱溶液(75mg/kg)腹腔注射处理，连续给药2周。测量小鼠的肿瘤体积及重量(图5A)，并且观察肿瘤形态(图5B)。发现苦参碱溶液处理后，肿瘤体积和重量均减小。Western blot法检测结果发现，PTEN和E-cadherin表达上调，p-Akt、N-cadherin、vimentin和Snail蛋白表达下调(图5C～D)。

图5 苦参碱对体内肿瘤生长和转移侵袭的影响A.肿瘤体积及重量变化; B.肿瘤形态; C.PTEN/PI3K/Akt通路相关蛋白表达; D.EMT相关蛋白表达

讨 论

EMT能够使肿瘤细胞获得侵袭和向远处转移的能力，进而侵入周围组织并形成转移灶，与肿瘤转移密切相关[14]。本研究发现苦参碱能够抑制人肺癌细胞迁移和侵袭，因此进一步研究苦参碱对EMT过程的影响。有研究报道PTEN能够抑制PI3K/Akt通路，进而影响细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭[15,16]。

在EMT过程中，肿瘤上皮细胞转化为间质细胞，并获得侵袭和向远处迁移能力[17]。肿瘤中央处的细胞常为上皮细胞表型，周围细胞常呈间质细胞表型，周围的细胞常具有较强的运动能力，使肿瘤细胞侵入循环系统而转移至靶器官[18]。这是恶性肿瘤侵袭、转移过程中关键的一步。目前已知苦参碱能够抑制多种肿瘤生长，而且抑制EMT的发生，进而抑制肿瘤转移和侵袭。然而，苦参碱在非小细胞肺癌的作用机制仍不清楚。本研究探讨了中药单体苦参碱对非小细胞肺癌生长和EMT过程的影响及其作用机制。

本研究选取A549和H1650作为人肺癌细胞体外模型。用0.5、1.0、2.0mg/ml浓度的苦参碱处理细胞，发现苦参碱减弱了人肺癌细胞的细胞活性，促进了细胞凋亡，并且伴随浓度依赖性。同时，苦参碱能够抑制人肺癌细胞迁移和侵袭。研究结果表明，苦参碱在非小细胞肺癌治疗中能够发挥作用。已知EMT过程与肿瘤转移密切相关，本研究通过进一步检测EMT相关蛋白表达，确定苦参碱在EMT过程中发挥的作用。

E-cadherin能够使肿瘤细胞之间相互黏附，当蛋白表达下降时，肿瘤上皮细胞发生EMT过程，并且向远处转移[19]。本研究发现苦参碱(1.0mg/ml)处理后，E-cadherin表达显著上调，N-cadherin、vimentin和Snail表达显著下调，肿瘤细胞相互间的黏附作用增强，EMT过程被抑制。同时，有研究报道PTEN 能够抑制PI3K/Akt通路，而PI3K/Akt通路能够调控EMT 关键转录因子Snail，进而调控EMT过程[20]。本研究检测了PTEN/PI3K/Akt通路相关蛋白，发现苦参碱(1.0mg/ml)处理后PTEN表达增多，p-Akt表达下调，进而影响了EMT过程。

本研究首先通过细胞实验证明了苦参碱通过PTEN/PI3K/Akt通路调控非小细胞肺癌EMT过程，进而影响细胞迁移和侵袭。成功构建了非小细胞肺癌小鼠模型，并用苦参碱溶液(75mg/kg)腹腔注射处理。连续给药一段时间后，处死小鼠，发现苦参碱抑制了肿瘤生长，并且引起PTEN/PI3K/Akt通路相关蛋白和EMT相关蛋白表达发生显著变化。通过体内实验，证明了苦参碱能够影响上皮间质转化过程进而影响肿瘤转移。

本研究通过体外和体内实验研究发现，苦参碱不仅能够影响肿瘤细胞生长，而且能够通过PTEN/PI3K/Akt通路调控非小细胞肺癌上皮间质转化，进而影响细胞迁移和侵袭。本研究为非小细胞肺癌的中药治疗及其相关研究提供了理论基础和科学依据。