三邻甲苯磷酸酯对人诱导多能干细胞来源的人脑类器官的毒性

陈学军，崔雅岚，王 陈，石 童，张瑞华，徐建富，李丽琴

（国民核生化灾害防护国家重点实验室，北京 102205）

三邻甲苯磷酸酯（tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）具有化学和热稳定性，可用作增塑剂、阻燃剂、软化剂使用，在工业上和日常生活中被广泛应用。TOCP作为有机磷酸酯类化合物的代表，具有严重的神经毒性，包括抑制胆碱酯酶产生急性神经毒性，一次或多次接触后的神经退行性综合征及迟发性神经毒性[1]。TOCP还是有机磷诱导的迟发性神经病（organophosphorus ester-induced delayed neuropathy，OPIDN）最常用的造模剂。研究表明，OPIDN大鼠大脑的多个部位氧化应激产物增加，抗氧化酶活性降低[2]。体外研究发现，TOCP可导致人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和大鼠星形胶质细胞C6氧化应激产物增加，抗氧化能力减弱[3-4]。目前对TOCP的神经毒性研究大多基于动物实验或体外单一细胞培养，相对于人体复杂的神经系统，存在跨种属差异、生理相关度低等问题。因此，开发人源化、生理相关度高的模型进行TOCP的神经毒性研究，对于评估其人体神经毒性及机制具有重要意义。

类器官是利用干细胞的诱导分化和聚集特性在体外培养的三维“迷你”器官，与对应的器官拥有类似的空间组织构成并能重现器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。类器官技术的出现及应用表明，中枢神经系统细胞多样性的可再生发育不需要胚胎环境，体外培养构建的人脑类器官具有与人大脑皮质类似的结构和细胞组成。单细胞测序分析表明，人脑类器官中表达有多种类型的神经元和胶质细胞，细胞发生顺序与体内脑发育过程类似[5-6]。神经类器官还可表现出相关的生理功能，形成功能性的神经环路，培养260 d的人脑类器官，可产生与早产儿脑电波信号相似的电信号[7]。Pellegrini等[8]构建的中枢脉络丛类器官，可分泌脑脊液。此外，相较于实验动物，人脑类器官由人源干细胞通过诱导分化而来，更能体现人体神经组织微环境与功能，可有效解决跨种属毒性效应差异及实验动物伦理学限制等问题。因此，人脑类器官相较于单独的神经元或胶质细胞更适用于化合物的神经毒性评估。人脑类器官已用于乙醇、纳米材料、新型冠状病毒等的神经毒性研究[9-13]。本研究拟应用人脑类器官进行TOCP的神经毒性评估，为阐明其人体神经毒性提供参考。

1 材料与方法

1.1 人脑类器官、试剂和主要仪器

人脑类器官（培养60 d左右）和人脑类器官维持培养基，浙江霍德生物工程有限公司。慢病毒包被的GCaMP6载体，武汉枢密脑科学技术有限公司；TOCP（纯度99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CellTiter-Glo®3D Reagent（CTG试剂），美国Promega公司；二甲基亚砜（纯度99%），美国Sigma-Aldrich公司。4%多聚甲醛，索莱宝生物科技有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；人丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒及BCA蛋白定量试剂盒，上海信裕生物科技有限公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）检测试剂盒，南京建成生物工程研究所。

6孔超低黏附细胞培养板和96孔超低黏附细胞培养板，美国Corning公司；细胞培养箱（3111），美国Thermo公司；倒置荧光显微镜（Ti2-U），日本Nikon公司；多功能酶标仪（Spark），瑞士Tecan公司；超声细胞破碎仪（VCX760），美国Sonics公司；台式高速冷冻离心机（5424R），德国Eppendorf公司。

1.2 人脑类器官培养和分组处理

人脑类器官培养于96孔超低黏附细胞培养板中，每孔1个，置于37℃，5% CO2细胞培养箱内的摇床上培养，转速70 r·min-1，每日换液。经1 d适应性培养后，分组给药，每组3个重复样本，分别为正常对照组、TOCP 1，5和10 mmol·L-1（终浓度）染毒组，染毒时间24 h。

1.3 CTG法检测人脑类器官细胞活力

取1.2分组处理的人脑类器官，吸去培养基，加入PBS清洗3次，加入100 μL培养基，室温平衡30 min，然后加入100 μL的CTG试剂，涡旋振荡使细胞完全裂解，室温继续孵育30 min。应用酶标仪进行化学发光检测，通过对ATP的定量来测定人脑类器官的细胞存活率，设定积分时间为每孔1 s，读取各孔发光值，计算各组细胞存活率。细胞存活率（%）=TOCP组发光值/正常对照组发光值×100%。

1.4 TUNEL法检测人脑类器官细胞凋亡

人脑类器官分为正常对照组和TOCP 5 mmol·L-1组，每组3个，正常对照组加入含0.1% DMSO置于细胞培养箱内摇床孵育24 h，收集人脑类器官，4%多聚甲醛固定，经抗冻保护、包埋、速冻、冷冻切片、TUNEL染色，进行荧光成像，观察人脑类器官细胞凋亡，以NIS-Elements AR软件分析各组TUNEL和DAPI荧光强度，两者比值表示细胞凋亡率。

1.5 倒置荧光显微镜检测人脑类器官钙震荡

rLV-EF1a-GCaMP6s-WPRE以培养液稀释至0.1 kU·L-1，与人脑类器官在培养箱中共孵育，8 h后换液，继续培养3 d。将转染了GCaMP6的人脑类器官转移至6孔超低黏附细胞培养板中，调节荧光倒置显微镜至4×物镜、FITC模式，观察人脑类器官钙成像效果。应用NIS-Elements AR软件，设置ND Acquisition模式记录荧光-时间变化，时长1 min，间隔无延迟，并通过时间测量功能分析1 min内钙荧光强度变化，选取钙震荡节律为3～9s的人脑类器官模型进行TOCP染毒分析。TOCP染毒时，设置记录时长为3 min，记录正常钙信号约40 s，加入TOCP（终浓度5 mmol·L-1）或者0.1% DMSO溶液，测试完成后，通过时间测量功能导出各时间点荧光值（Ft），设起始荧光值F0为1，计算各时间点相对荧光值（Ft/F0）并作图，根据相对荧光值变化曲线判断细胞内钙浓度变化。

1.6 比色法检测人脑类器官H2O2，MDA，NO，T-AOC和GSH含量以及SOD和GSH-PX活性

取1.2分组处理的人脑类器官，以预冷PBS轻轻冲洗3次，每孔加入200 μL PBS重悬，用宽口移液吸头转移至无菌离心管内，冰浴下超声破碎20 s，使细胞完全裂解。4℃下13 000×g离心15 min，取上清液，参照试剂盒说明书检测氧化应激产物H2O2，MDA和NO含量，T-AOC，GSH含量，以及抗氧化酶SOD和GSH-PX活性，各指标含量均以各自样本的总蛋白含量进行校正。

1.7 统计学分析

实验结果数据用±s表示，采用SPSS19.0软件进行数据分析，多组间比较采用单因素方差分析析（One-way ANOVA）结合 Dunnettt检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TOCP对人脑类器官细胞存活率的影响

图1结果显示，与正常对照组相比，TOCP 1 mmol·L-1组人脑类器官细胞存活率无显著差异，5和10 mmol·L-1组分别为正常对照组的（83±6）%和（79±10）%，均显著下降（P＜0.05），表明TOCP 5和10 mmol·L-1对人脑类器官具有毒性作用。

Fig.1 Effect of tri-ortho-cresyl phosphate（TOCP）on cell viability of human brain organoids.Brain organoids were treated with TOCP for 24 h and cell viability was determined with CellTiter-Glo® 3D Reagent.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control(0 mmol·L-1)group.

2.2 TOCP对人脑类器官细胞凋亡的影响

TUNEL染色显示（图2），正常对照组人脑类器官内部细胞凋亡较少，TOCP 5 mmol·L-1组人脑类器官内部出现大量细胞凋亡（绿色荧光），荧光强度显著高于正常对照组（P＜0.01）表明TOCP可诱导人脑类器官细胞凋亡，具有显著的神经毒性。

Fig.2 Effect of TOCP on cell apoptosis of human brain organoids by TUNEL staining.See Fig.1 for the treatment.Green fluorescence indicates apoptotic cells.B was the quantitative result of A.Apoptosis rate（%）=TUNEL intensity/DAPI intensity×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 TOCP对人脑类器官细胞钙震荡的影响

倒置荧光显微镜下可见，正常对照组人脑类器官钙震荡出现扰动，但很快恢复，且荧光强度和节律未受明显影响（图3A）；TOCP 5 mmol·L-1组人脑类器官钙震荡信号紊乱（图3B），表现为钙震荡幅度和荧光强度的持续增强，表明TOCP可使细胞内钙离子浓度升高，导致钙稳态失衡。

Fig.3 Effect of TOCP on calcium oscillations of human brain organoids.See Fig.1 for the treatment.Ft：real time fluorescence intensity；F0：initial fluorescence intensity.

2.4 TOCP对人脑类器官H2O2，MDA，NO，T-AOC，GSH含量及SOD和GSH-PX活性的影响

如表1所示，与正常对照组比较，TOCP各组人脑类器官H2O2水平均显著增加（P＜0.01），其含量分别为正常对照组的1.30，2.55和2.37倍；其中TOCP 10 mmol·L-1组 MDA 含量升高（P＜0.01）。提示TOCP可引起脂质过氧化产物增加（P＜0.01）。各组NO水平与正常对照组比较无明显变化。与正常对照比较，TOCP 5和10 mmol·L-1组T-AOC显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TOCP 1，5和10 mmol·L-1显著GSH含量（P＜0.05，P＜0.01）。与正常对照比较，TOCP 5和10 mmol·L-1组人脑类器官SOD活性显著降低（P＜0.01）；TOCP 1，5和 10 mmol·L-1组GSH-Px活性显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示TOCP可破坏人脑类器官的抗氧化能力，导致氧化应激损伤。

Tab.1 Effect of TOCP on levels of hydrogen peroxide（H2O2）,malondialdehyde（MDA）,nitric oxide（NO）,total antioxidant capacity（T-AOC）,glutathione（GSH），and activity of superoxide dismutase（SOD）,glutathione peroxidase（GSH-Px）in human brain organoids

3 讨论

本研究结果表明，TOCP可诱导人脑类器官细胞凋亡，降低细胞存活率，具有显著的神经毒性。TOCP的神经毒性机制可能与其诱导人脑类器官的钙震荡节律紊乱相关。本研究结果表明，TOCP可引起人脑类器官钙离子震荡幅度增大、强度持续增强，表明细胞内的钙离子浓度提升，钙稳态失衡。钙稳态失衡参与有机磷类化合物诱导的神经组织损伤[14]。Fernandes等[15-16]研究报道，神经元L型钙离子通道和T型钙离子通道参与了丙胺氟磷诱导的OPIDN过程。Ding等[16]报道，TRPV1通道阻断剂HC030031能够改善马拉硫磷或TOCP导致的神经损伤和共济失调等OPIDN表现。敌敌畏长期暴露可导致大鼠脑突触内钙离子浓度升高，主要钙外排酶（如Ca2+-ATP酶）活性降低，去极化引起电压依赖的钙离子通道开放，钙摄取增加、辅酶活性增强，表明细胞内钙稳态失衡介导了敌敌畏的慢性神经毒性，导致神经功能损伤[17]。

胞浆内钙离子的持续高浓度增加，尤其是线粒体中的钙离子增加会导致自由基和氧化应激产物的增加[18]。有机磷化合物暴露会导致氧化应激反应[19]。如引起脑中内源性抗氧化酶和非酶抗氧化剂活性改变、线粒体功能损伤以及自由基介导的损伤（如脂质过氧化）增加[20-21]。Zhang等[22]报道，母鸡单次灌胃给予750 mg·kg-1TOCP使鸡大脑、脊髓和坐骨神经等组织MDA含量升高，SOD和GSH-PX等抗氧化酶的活性降低，GSH含量下降。龙鼎新等[4]研究发现，TOCP孵育的SH-SY5Y细胞，MDA水平增加且H2O2酶含量降低，提示TOCP导致神经细胞抗氧化能力减弱，脂质氧化物水平增加。刘晓晖等[3]报道，TOCP处理的大鼠C6星形胶质细胞，LDH释放增加，细胞存活率减弱，抗氧化物GSH含量降低，GSH-PX活性下降，表明TOCP引起星形胶质细胞的氧化应激损伤。因此，TOCP的神经毒性效应是神经元和胶质细胞等共同作用的结果。本研究结果表明，TOCP处理的人脑类器官，抗氧化物质GSH含量降低，抗氧化酶SOD和GSH-PX活性减弱，T-AOC下降，氧化应激产物MDA和H2O2增加。本研究结果表明，TOCP诱导人脑类器官的氧化应激反应，而氧化应激是细胞凋亡的保守信号。因此，钙稳态失衡可能通过氧化应激反应介导了细胞的凋亡。

综上所述，本研究结果表明，TOCP对人脑类器官具有显著毒性，其机制可能是通过破坏人脑类器官的钙稳态失衡，增加细胞内钙离子浓度，引起氧化应激紊乱，从而介导了细胞凋亡等发生。但人脑类器官中的神经元和胶质细胞等各类型细胞在TOCP所诱导损伤中的程度、作用及机制等还有待深入研究。