一种新的槟榔根腐病病原菌鉴定

杨德洁，余凤玉，牛晓庆，宋薇薇，唐庆华，覃伟权

(中国热带农业科学院椰子研究所/海南省槟榔产业工程研究中心，海南文昌，571339)

槟榔是我国四大南药之首，其果、种子、皮、花均可入药[1]。目前，中国已跃居为世界第二大槟榔生产国，而中国槟榔产量的95%以上都来自海南省[2]。近年来，槟榔病虫害频发，对海南省槟榔产业的健康发展造成严重威胁。受槟榔病虫害等因素影响，2020年海南省槟榔产量较2019年下降约2.9%，打破了连续多年槟榔产量持续增长的趋势[3]。其中槟榔根腐病为害严重，一度成为海南岛槟榔主产区影响槟榔生产的主要障碍之一[4]。引起槟榔根腐病的病原菌种类多样，目前国内已报道的槟榔根腐病病原菌包括Phellinusnoxius、Ustulinadeusta、Ganodermalucidum[4-5]，以及镰刀菌可引起槟榔镰刀菌根颈腐烂病[6]等。

大部分根腐病菌感染槟榔后都会引起槟榔根部坏死，地上部叶片变色发黄或枯死，甚至全株枯死，严重影响槟榔生长。2019—2020年笔者在海南岛东部地区调查槟榔根腐病发现，一种不常见的槟榔根腐病症状根部病害。通过采集样品、组织分离培养、致病性测定、形态学观察等明确该病原菌为可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobromae，并对该病原菌的生物学特性进行初步研究，以期为该病害发生规律探究和综合防治措施制订提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株为分离自发病槟榔根部的菌株，供试植物为中国热带农业科学院椰子研究所“热研1号”槟榔苗(3～4片叶)。

1.2 方法

1.2.1 田间样品采集 2019—2020年调查中，在海南岛琼海市槟榔种植区发现一种与已报道槟榔根腐病症状不同的根部病害，进行田间症状观察与记录后，对病株整体形态与根部进行拍照，将采集的样品放入冰盒带回实验室。

1.2.2 病原菌的分离纯化 采用常规组织分离法对发病植株进行病原物分离纯化。用清水将病根表面泥土冲洗后，再用75%酒精脱脂棉擦洗表面，用无菌刀片在病健交界处切取长约1.0 cm的病根组织，置于75%酒精中浸泡30 s，用1%NaClO表面消毒3～5 min，无菌水漂洗3次，将其放在无菌滤纸上吸干水分，用无菌刀片去除表皮后切成约2 mm×5 mm的组织块，然后转移到PDA平板上培养；待长出菌落后，挑取菌落边缘菌丝转接至新鲜PDA平板上培养，多次转接直至菌落形态一致，最后将纯化好的菌落转移到PDA斜面保存待用[7]。

1.2.3 病原菌的致病性测定 采用柯赫氏法则对分离纯化菌株进行致病性测定。采用蘸根法[8]接种：用灭菌针头损伤健康槟榔幼苗根部，将损伤的植株于13 g/L菌丝悬浮液中浸泡30 min，无菌湿润脱脂棉包裹后移至无菌塑料盒中，根部遮光培养，以无菌水浸泡30 min作为对照，每处理重复3次。自然光照，定期补充水分并观察记录植株发病状态，发病后对发病组织进行病原菌分离培养，鉴定再次分离到的病菌性状是否与原始分离菌相同。

1.2.4 病原菌的形态学鉴定 进行致病性验证的同时，将纯化菌株接种到PDA平板上，参照Alves等[9]培养条件，分别在全黑暗及全光照培养箱中培养，观察菌落形态和色泽，测量菌落直径，并在显微视野下观察分生孢子等形态特征，并测量孢子大小。

1.2.5 病原菌的分子学鉴定 将纯化后的菌株28 ℃培养5～7 d后，采用真菌DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提取DNA。利用rDNA-ITS序列引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)/ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)进行PCR扩增，引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。50 μL PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL(北京索莱宝科技有限公司)、引物各2 μL、DNA模板1.5 μL，加去离子水[天根生化科技(北京)有限公司]补足至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃再延伸10 min，10 ℃保存。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min，PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序所得序列进行BLAST比对分析，并从GenBank数据库中下载与待测菌株同属的标准菌株ITS序列以及外群标准菌株ITS序列，运用MEGA-X软件进行序列比对及构建系统发育树(邻接法)。

2 结果与分析

2.1 田间症状

该病原菌主要为害槟榔根部，同时叶部会有变色或枯死。发病初期病根表面发黑有菌丝缠绕，但无明显坏死；随着病菌扩展，病根木质部逐渐变褐腐烂且易与皮层分离，下部叶片变黄并自下而上、由叶尖向内部发展，最终整株变色或枯死(见图1)。

图1 槟榔根腐病发病植株叶部、根部症状(左)和致病性验证的叶部、根部症状(右)

2.2 致病性测定

对分离得到的菌株进行致病性验证，蘸根7 d后，健康槟榔苗下部叶片从叶尖开始变黄，并逐渐向上扩展，根部木质部变褐且易与皮层分离，针刺处较为明显(见图1)；对照均未发病。取发病植株根部样品，对病健交界处组织进行分离培养，获得与最初分离的病原菌一致的菌株。根据柯赫氏法则，说明分离的病原菌为槟榔根腐病的致病菌。

2.3 病原菌形态鉴定

该病原菌在PDA平板上生长迅速，光照和黑暗条件下2～3 d均可长满整皿(直径9 cm)，菌丝发达，绒毛状，菌落边缘不整齐。光照和黑暗条件下，菌落初期灰白色，随着培养时间增加，菌落颜色不断变深，最后呈灰黑色(见图2)，显微观察发现菌丝分隔且有分支。黑暗和光照培养菌株有差异，光照培养的菌株培养后期会产生垫状子座，而黑暗培养的菌株产生子座数量极少或不产生子座。将子座内的分生孢子器切开，在显微镜下观察，可看到大量未成熟和成熟的分生孢子。未成熟分生孢子为椭圆形或卵形，单孢，颜色浅，细胞壁较薄，大小为(11.83～17.02) μm×(20.95～30.90) μm；成熟分生孢子为椭圆形或卵形，中间有一分隔(双孢)，颜色深，细胞壁厚，大小为(11.36～15.19) μm×(21.45～27.56) μm(见图3)。这些形态特点都基本符合可可毛二色孢菌的特征[10]，试验过程中未观察到其有性阶段。

图2 槟榔根腐病病原菌在PDA培养基上的菌落性状

图3 槟榔根腐病病原菌分生孢子器(a)、分生孢子(b)及菌丝(c)形态特征

2.4 病原菌分子鉴定

将测序得到的rDNA-ITS序列通过BLAST进行比对分析，结果显示其与多个Lasiodiplodiatheobromae菌株的相似度高达99%以上。为了进一步鉴定菌株，我们在NCBI中下载了10个Lasiodiplodia属标准菌株的ITS序列，并将Botryosphaeriadothidea(NR-111146.1)和Botryosphaeriascharifii(NR-111719.1)作为外群，通过MEGA-X软件进行序列比对与构建系统发育树[11]。结果显示目标菌株Q-7-1与Lasiodiplodiatheobromae聚为一类(见图4)，且具有很高的自举支持率，从而在系统学角度证明了Q-7-1为可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobromae。

图4 槟榔根腐病病原菌株Q-7-1基于rDNA-ITS序列构建的Lasiodiplodia属系统发育树

3 结论与讨论

本研究通过生物学与分子学鉴定方法，最终确定可可毛色二孢菌为导致槟榔根腐病的新病原菌，这是可可毛色二孢菌引起槟榔根腐病的首次报道。可可毛色二孢菌L．theobromae是子囊菌门(Ascomycota)葡萄座腔菌Botryosphaeriarhodina的无性态，为多寄主土传病原真菌，它能引起林木、蔬菜、水果和大田作物等280多种植物田间和贮藏病害[12]，且在不同寄主上症状表现不同，包括梢枯、枝枯、根腐、果腐、叶斑、溃疡、流胶、变色、坏死等，在我国主要引起叶斑、溃疡、流胶、梢枯和根腐等症状[13]。可可毛色二孢菌为弱寄生茵，一般在寄主植物长势衰弱、树体产生伤口或外界胁迫时更易被侵染致病[14]。本研究分离到的病原菌均来自3～4年生幼龄槟榔树，暂未在壮年大树根部分离到该病原菌，猜测可能与幼龄槟榔树体较弱有关。

可可毛色二孢菌的菌丝生长和产孢是否需要光照是目前研究者较为关注的问题。有学者认为连续光照24 h条件下更有利于其菌丝生长[15]，但也有研究认为光照对其菌丝生长、分生孢子器和分生孢子的形成没有影响[16]。而本研究发现光照和黑暗对其菌丝生长没有明显影响，但连续24 h光照更有利于其分生孢子器和分生孢子的产生，这与谢红辉等对可可毛色二孢菌的研究结论一致[17]，并且这两者均分离自发病根部，是否由于寄主或寄生部位的不同而导致其对光照需求差异，这需要进一步研究。

笔者在调查过程中还在槟榔根部分离到了一种与可可毛色二孢菌培养性状极为相似的菌株，经鉴定为假可可毛色二孢菌Lasiodiplodiapseudotheobromae，致病性验证试验中其并未引起槟榔植株发病。这两株菌分别来自海南的不同市县，在PDA培养基上菌落形态几乎一样，仅通过肉眼无法区分。有相关研究表明，假可可毛色二孢菌可以引起蓝莓、龙眼、橡胶、桂花、莲雾等多种作物的溃疡、枝枯及果腐等症状[18]，后续可在两种菌的区分方法以及生物学特性分析上再进行相关深入研究。