白山毛桃根提取物通过调控miR-182-5p/PCDH10表达抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、侵袭

胡玉海 王晨 谢宇端 余婷 汪浩

(1武汉市汉口医院检验科，湖北 武汉 430012；2中国中医科学院望京医院检验科；3武汉市精神卫生中心检验科)

非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌亚型，是全球癌症相关死亡的重要原因〔1〕。目前，包括手术、化疗、放疗等治疗方式存在不足之处，亟待开发新的NSCLC治疗策略〔2〕。研究发现中药辅助治疗能改善NSCLC患者生活质量，降低不良反应，对提高其远期生存具有一定优势〔3，4〕。白山毛桃根是民间传统中药，其在胃癌、鼻咽癌、乳腺癌已被证实具有抗肿瘤活性〔5，6〕。白山毛桃根提取物对黑色素瘤细胞异常迁移和侵袭、白血病细胞增殖具有抑制作用〔7〕。本实验探索了白山毛桃根提取物对NSCLC细胞生物学行为的影响，并分析其抗肿瘤作用与miR-182-5p/原钙黏蛋白细胞黏附分子(PCDH10)轴的关系。

1 资料与方法

1.1材料与试剂 人NSCLC细胞株H1299购自中国科学院上海细胞库。RT-qPCR试剂盒(日本Takara公司)；RPMI1640培养基(美国Gibco公司)；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)(美国R&D Systems)；蛋白提取试剂盒(碧云天生物公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1白山毛桃根提取物溶液的配制 参考王水英〔7〕实验方法制备白山毛桃根提取物，准确称量50 g白山毛桃根，浸泡1 h后加热煮沸1 h，然后过滤收集残渣，再进行二次煮沸、过滤。合并两次滤液，过滤、除菌保存。

1.2.2细胞处理与分组 H1299细胞常规培养于RPMI1640培养基中，分别用10、20、40、60 μg/ml的白山毛桃根提取物处理H1299细胞，作为不同浓度白山毛桃根提取物组，不作任何处理的作为对照组；将miR-182-5p抑制剂及其阴性对照转染至H1299中，记为anti-miR-182-5p组、anti-miR-NC组；将miR-182-5p、miR-NC转染至H1299后用40 μg/ml白山毛桃根提取物处理，记为白山毛桃根提取物+miR-182-5p组、白山毛桃根提取物+miR-NC组。

1.2.3RT-qPCR检测miR-182-5p和PCDH10 mRNA表达 提取H1299细胞总RNA，逆转录成cDNA，随后参照荧光定量说明进行PCR扩增；miR-182-5p和PCDH10 mRNA的相对表达量以2-ΔΔCt公式计算。

1.2.4Western印迹检测PCDH10蛋白表达 提取H1299细胞的蛋白，煮沸变性后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，湿式转膜装置转移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶封闭，加入一抗4℃孵育膜过夜，二抗室温孵育膜2 h。显影、定影，分析PCDH10蛋白条带相对灰度值。

1.2.5MTT法测定NSCLC H1299细胞增殖 各组细胞培养48 h后，按试剂盒说明加入MTT和DMSO试剂，酶标仪检测490 nm处OD值，计算细胞抑制率(%)。

1.2.6Transwell法检测H1299细胞的迁移和侵袭数 收集anti-miR-NC组、anti-miR-182-5p组、白山毛桃根提取物+miR-NC组、白山毛桃根提取物+miR-182-5p组H1299细胞进行无血清培养，接种于Transwell 小室上层，培养24 h后去除培养液，清洗细胞，风干Transwell小室后，用结晶紫染色，显镜下计数。侵袭实验时选择包被基质胶的Transwell小室，其余步骤同迁移实验。

1.2.7荧光素酶报告基因实验 构建PCDH10的野生型和突变型荧光素酶报告载体(WT-PCDH10和MUT-PCDH10)，将其分别与miR-182-5p和miR-NC转染到H1299细胞，使用试剂盒检测荧光素酶活性。

1.3统计学分析 用SPSS20.0软件进行t检验，方差分析。

2 结 果

2.1白山毛桃根提取物对H1299细胞增殖的影响 与对照组比较，白山毛桃根提取物(10、20、40、60 mg/ml)组H1299细胞24 h、48 h、72 h时的抑制率显著升高，且具有浓度依赖性(P<0.05)，见表1。后续选择40 mg/ml的白山毛桃根提取物作用48 h(抑制率约50%)进行实验。

表1 白山毛桃根提取物对H1299细胞增殖的影响

2.2白山毛桃根提取物对H1299细胞迁移、侵袭的影响 白山毛桃根提取物组H1299细胞迁移数量、侵袭数量显著低于对照组(均P<0.001)，见表2。

表2 白山毛桃根提取物对H1299细胞迁移、侵袭的影响个)

2.3白山毛桃根提取物对H1299细胞中miR-182-5p和PCDH10表达的影响 白山毛桃根提取物组H1299细胞中PCDH10 mRNA和蛋白的表达水平明显高于对照组(P<0.05)，而miR-182-5p表达水平明显低于对照组(P<0.05)，见图1，表3。

表3 白山毛桃根提取物对H1299细胞中miR-182-5p和PCDH10表达的影响

图1 白山毛桃根提取物对PCDH10蛋白表达的影响

2.4miR-182-5p靶向调控PCDH10的表达 TargetScan预测显示PCDH10的3′UTR与miR-182-5p有结合位点(图2)。miR-182-5p和WT-PCDH10共转染显著降低细胞的荧光素酶活性(P<0.001)；而miR-182-5p和MUT-PCDH10共转染后细胞荧光素酶活性变化无统计学意义(P>0.05)，见表4。过表达miR-182-5p可降低PCDH10蛋白表达(miR-NC组：0.42±0.03、miR-182-5p组：0.17±0.03，P<0.05)；抑制miR-182-5p表达可提高PCDH10蛋白的表达(anti-miR-NC组：0.37±0.04，anti-miR-182-5p组：0.72±0.07，P<0.05)，见图3。

图2 PCDH10与miR-182-5p互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

1～4：miR-NC组、miR-182-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-182-5p组图3 miR-182-5p调控PCDH10蛋白表达

2.5抑制miR-182-5p表达对H1299细胞迁移、侵袭的影响 anti-miR-182-5p组H1299细胞miR-182-5p表达水平明显低于anti-miR-NC组，迁移和侵袭数量显著低于anti-miR-NC组(均P<0.001)，见表5。

表5 抑制miR-182-5p表达对H1299细胞迁移、侵袭的影响

2.6miR-182-5p过表达减弱了白山毛桃根提取物对H1299细胞生物学行为的影响 与白山毛桃根提取物+miR-NC组相比，白山毛桃根提取物+anti-miR-182-5p组miR-182-5p表达水平升高，PCDH10蛋白表达水平和细胞抑制率降低，H1299细胞迁移和侵袭数量升高(P<0.05)，见图4，表6。

1～4：对照组、白山毛桃根提取物组、白山毛桃根提取物+miR-NC组、白山毛桃根提取物+miR-182-5p组图4 Western印迹检测PCDH10蛋白表达

表6 过表达miR-182-5p减弱了了白山毛桃根提取物对H1299细胞增殖、迁移、侵袭的影响

3 讨 论

NSCLC是全球范围内死亡率和发病率最高的恶性肿瘤，已给人类身体健康和生命安全造成巨大威胁〔8〕。中医药治疗主要是从消除患者体内肿瘤生长的条件环境，促进免疫，防止肿瘤的转移等来实现抗肿瘤的作用；能够提高患者的生存质量，延长生存期〔9〕。白山毛桃根具有抗肿瘤、抗炎和免疫调节的作用〔10〕。林水花等〔11〕研究表明相较于地上部分，毛花猕猴桃的根对胃癌、鼻癌、乳腺癌有抑制作用。毛花猕猴桃根提取物对体外肿瘤细胞有抑制作用，还可以增强小鼠巨噬细胞的吞噬作用〔12〕。毛花猕猴桃根提取物可抑制肝癌细胞增殖〔13〕。研究发现白山毛桃根提取物能抑制胃癌〔14〕、人红白血病K562细胞〔15〕、黑色素瘤M21细胞〔16〕的增殖，促进细胞凋亡。毛花猕猴桃中提取出的多糖能抑制小鼠移植性S180肉瘤的生长，促进脾细胞增殖，增强自然杀伤细胞活性〔17〕；还能提高细胞免疫能力〔18〕。

miR-182已被报道在肺癌〔19〕、结肠癌〔20〕、胃癌〔21〕等多种肿瘤中表达上调。研究发现与未接受治疗NSCLC患者相比，接受中西医联合治疗且疗效获益的晚期NSCLC患者miR-182-5p表达显著降低〔22〕。miR-182高表达与NSCLC细胞浸润程度、淋巴结转移呈正相关〔23〕。miR-182通过下调靶基因RECK、PFN1表达可诱导NSCLC细胞增殖和转移〔24，25〕。此外，下调miR-182-5p表达还可提高NSCLC细胞对顺铂的敏感性〔26〕。

PCDH10是近年发现的肿瘤抑制基因〔27〕，其在多种肿瘤中下调表达或缺失，影响肿瘤细胞的恶性生物学行为〔28〕。研究表明PCDH10甲基化状态可用于评估病理Ⅰ期非小细胞肺癌根治性切除术的预后〔29〕。PCDH10启动子甲基化诱导的PCDH10表达下调或缺失还可促进宫颈癌进展〔30〕。胰腺癌、非小细胞肺癌中PCDH10表达下降，恢复PCDH10表达明显抑制肿瘤细胞增殖和转移〔31～33〕。此外，PCDH10对子宫内膜腺样癌进展亦具有抑制作用〔34〕。

研究发现miRNA广泛参与中药抗肿瘤的作用过程，中药作用后通过上调或下调miRNA的表达，促进其靶基因降解或抑制其靶基因的翻译来发挥中药抗肿瘤的作用〔35〕。清热燥湿类中药通过调节miR-124的表达治疗湿疹炎症〔36〕。丹皮酚通过上调miR-19b的表达，进而调控miR-19b靶基因TNFRSF12A抑制人肝癌HepG2细胞增殖、促进其凋亡〔37〕。姜黄素可以降低miR-21的转录水平，进而提高miRNA-21靶基因PDCD4的表达促进肿瘤细胞凋亡〔38〕。白藜芦醇下调miR-151表达可抑制肝癌发生〔39〕。miRNA调控机制为中医药治疗癌症提供了新的视角、研究思路和理论依据〔40〕。

本研究发现，不同浓度白山毛桃根提取物处理后H1299细胞的抑制率显著升高，迁移和侵袭的细胞数量低；且白山毛桃根提取物降低了miR-182-5p的表达水平，提高了PCDH10的表达水平；且miR-182-5p可靶向调控PCDH10 的表达，抑制miR-182-5p表达后H1299细胞的迁移和侵袭数量降低，而miR-182-5p过表达可逆转白山毛桃根提取物对H1299细胞恶性生物学行为的抑制作用。

总之，白山毛桃根提取物可能通过调控miR-182-5p/PCDH10抑制NSCLC细胞H1299增殖、迁移和侵袭。