花姜酮调控miR-490-3p/Bcl-w诱导肝癌细胞凋亡和抑制细胞迁移、侵袭的机制

曹斌

(莱芜市人民医院急诊科，山东 莱芜 271100)

肝癌是威胁人类生命安全的恶性肿瘤之一，大部分患者就诊时已处于中晚期，研究表明肝癌细胞增殖、基质黏附及侵袭能力与患者预后不良密切相关〔1，2〕。研究表明花姜酮(Zerumbone)可抑制肝癌、乳腺癌等肿瘤细胞增殖及侵袭〔3，4〕。但关于Zerumbone对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用机制尚未完全阐明。微小RNA(miRNA)在多种肿瘤中异常表达，并参与肿瘤进展，研究表明miR-490-3p在卵巢癌、肝癌等肿瘤细胞中呈低表达〔5～7〕。Targetscan预测显示B细胞淋巴因子(Bcl)-w可能是miR-490-3p的靶基因，Bcl-w在多种肿瘤中发挥促癌基因作用〔8〕。本研究主要探讨Zerumbone对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响，并分析其对miR-490-3p/Bcl-w的调控作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 Zerumbone购自上海甄准生物科技有限公司(货号：ZPG-83418，规格：20 mg)；肝癌细胞Hep3B购自上海通派生物科技有限公司。pcDNA3.1购自上海索宝生物科技有限公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；Transwell小室购自美国Corning公司；基质胶购自美国BD公司；MTT购自上海歌凡生物科技有限公司；细胞凋亡试剂盒购自上海朗智生物科技有限公司；兔抗人细胞周期蛋白(CyclinD)1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved caspase)-3抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗人Bcl-w抗体购自美国Santa Cruz公司；二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司；Trizol试剂、反转录与SYBR Green试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

1.2实验处理与分组 Zerumbone溶解于200 μl二甲基亚砜(DMSO)，用DMEM培养基稀释为实验所需浓度7.5 μmol/L、15.0 μmol/L、 30.0 μmol/L。取对数生长期Hep3B细胞，用不同浓度的Zerumbone处理Hep3B细胞48 h，实验分组：Zerumbone 0.0 μmol/L组、Zerumbone 7.5 μmol/L组、Zerumbone 15.0 μmol/L组、Zerumbone 30.0 μmol/L组。实验分组：miR-con组(miR-con转染至Hep3B细胞)、miR-490-3p组(miR-490-3p mimics转染至Hep3B细胞)、anti-miR-con组(anti-miR-con转染至Hep3B细胞)、anti-miR-490-3p组(anti-miR-490-3p转染至Hep3B细胞)，各组细胞转染48 h，严格按照Lipofectamine2000试剂说明书进行操作。后续实验为验证Zerumbone对miR-490-3p/Bcl-w的调控作用，实验分组：miR-490-3p+pcDNA组(miR-490-3p mimics与pcDNA共转染至Hep3B细胞48 h)、miR-490-3p+pcDNA-Bcl-w组(miR-490-3p mimics与pcDNA-Bcl-w共转染至Hep3B细胞48 h)、Zerumbone+pcDNA组(pcDNA转染至Hep3B细胞48 h，用含有30 μmol/L的Zerumbone培养液培养48 h)、Zerumbone+pcDNA-Bcl-w组(pcDNA-Bcl-w转染至Hep3B细胞48 h，用含有30 μmol/L的Zerumbone培养液培养48 h)。

1.3MTT检测细胞增殖 取对数生长期Hep3B细胞，接种于96孔板(3×104个/孔)，按照“1.2.1”分组，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl/孔，室温孵育4 h，弃上清，加入150 μl DMSO/孔，混匀，酶标仪检测490 nm处的吸光度(OD)，细胞活力(%)=(实验组OD/对照组OD)×100%。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡 取各组对数生长期Hep3B细胞，按照凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡。

1.5Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 细胞迁移：取200 μl Hep3B细胞悬液(5×104个/ml)接种于小室上室，600 μl培养液(含10%胎牛血清)加入下室，培养24 h，弃上清，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染液染色10 min，显微镜下随机选取5个视野计数。细胞侵袭：预冷培养液以9∶1比例稀释基质胶，并铺于小室上室(40 μl/孔)，其余步骤同细胞迁移。

1.6qRT-PCR检测细胞中miR-490-3p、Bcl-w mRNA表达水平 取各组Hep3B细胞，Trizol试剂提取细胞总RNA，反转录为cDNA，qRT-PCR检测miR-490-3p、Bcl-w mRNA相对表达量。

1.7荧光素酶报告基因检测 实验分成4组：WT-Bcl-w+miR-con共转染组、WT-Bcl-w+miR-490-3p mimics共转染组、MUT-Bcl-w+miR-con共转染组、MUT-Bcl-w+miR-490-3p mimics共转染组，转染48 h，收集细胞，根据荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测各组相对荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值)。

1.8Western印迹检测CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Cleaved caspase-3、Bcl-w蛋白表达 收集各组Hep3B细胞，提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)测定蛋白浓度，每组上样量30 μg，沸水煮10 min，十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入CyclinD1(1∶1 000)、MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)、Cleaved caspase-3(1∶1 000)、Bcl-w(1∶500)一抗稀释液，4℃孵育24 h，TBST洗涤，加入二抗稀释液(1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，曝光显影，应用凝胶成像分析系统及ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.9统计学处理 采用SPSS21.0软件进行正态分布检验及组间方差齐性检验，符合正态分布及方差齐性，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布、方差齐性分析的数据，采用Kruska-WallisH进行统计处理。

2 结 果

2.1Zerumbone抑制肝癌细胞增殖和诱导细胞凋亡 与Zerumbone 0.0 μmol/L组相比，Zerumbone 7.5 μmol/L组、Zerumbone 15.0 μmol/L组、Zerumbone 30.0 μmol/L组肝癌细胞活力、CyclinD1蛋白表达量降低，细胞凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表达量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中Zerumbone 30.0 μmol/L时作用效果较好，用于后续实验，见图1、图2、表1。

图1 流式细胞术检测肝癌细胞凋亡

1～4：Zerumbone 0.0 μmol/L组、Zerumbone 7.5 μmol/L组、 Zerumbone 15.0 μmol/L组、Zerumbone 30.0 μmol/L组；图4、图5同图2 Western印迹检测CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表达

表1 不同浓度的Zerumbone对肝癌细胞的增殖和细胞凋亡及迁移、侵袭的影响

2.2Zerumbone抑制肝癌细胞迁移和侵袭 相较于Zerumbone 0.0 μmol/L组，Zerumbone 7.5 μmol/L组、Zerumbone 15.0 μmol/L组、Zerumbone 30.0 μmol/L组迁移及侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9蛋白表达量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、图3、图4。

图3 Transwell检测肝癌细胞的迁移(结晶紫，×200)

图4 Western印迹检测MMP-2和MMP-9蛋白表达

2.3Zerumbone对肝癌细胞miR-490-3p和Bcl-w表达的影响 与Zerumbone 0.0 μmol/L组相比，Zerumbone 7.5 μmol/L组、Zerumbone 15.0 μmol/L组、Zerumbone 30.0 μmol/L组肝癌细胞中miR-490-3p表达水平升高，Bcl-w mRNA及蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5、表2。

图5 Western印迹检测肝癌细胞Bcl-w蛋白表达

表2 花姜酮调控肝癌细胞miR-490-3p和Bcl-w表达

2.4miR-490-3p靶向调控Bcl-w表达 miR-490-3p与Bcl-w存在靶向序列，见图6。转染克隆有Bcl-w-3′UTR载体质粒实验中，miR-490-3p组荧光素酶活性明显受到抑制(P<0.05)，见表3。miR-con组、miR-490-3p组、anti-miR-con组、anti-miR-490-3p组Bcl-w蛋白表达分别为：0.61±0.04、0.19±0.03、0.55±0.03、0.87±0.09，miR-490-3p组显著低于miR-con组，anti-miR-490-3p组显著高于anti-miR-con组(P<0.05)。miR-490-3p可负向调控Bcl-w的表达，见图7。

图6 miR-490-3p与Bcl-w存在靶向序列

表3 双荧光素酶报告实验

1～4：miR-con组、miR-490-3p组、anti-miR-con组、anti-miR-490-3p组图7 Western印迹检测肝癌细胞Bcl-w蛋白表达

2.5Bcl-w过表达逆转miR-490-3p对肝癌细胞的抑制作用 与miR-con组相比，miR-490-3p组肝癌细胞活力、迁移、侵袭细胞数、Bcl-w、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达量降低，细胞凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表达量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；相较于miR-490-3p+pcDNA组，miR-490-3p+pcDNA-Bcl-w组肝癌细胞活力、迁移、侵袭细胞数、Bcl-w、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达量升高，细胞凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表达量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4、图8。

表4 Bcl-w过表达和转染miR-490-3p对肝癌细胞存活、迁移、侵袭和细胞凋亡的影响

1～4：miR-con组、miR-490-3p组、miR-490-3p+pcDNA组、miR-490-3p+pcDNA-Bcl-w组图8 Western印迹检测肝癌细胞Bcl-w、MMP-2、MMP-9、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表达

2.6Bcl-w过表达部分逆转Zerumbone对肝癌细胞的抑制作用 与Zerumbone+pcDNA组比较，Zerumbone+pcDNA-Bcl-w组肝癌细胞活力、迁移、侵袭细胞数、Bcl-w、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达量升高，细胞凋亡率、Cleaved caspase-3蛋白表达量降低(P<0.05)，见表5、图9。

表5 Bcl-w过表达和Zerumbone处理对肝癌细胞存活、迁移、侵袭和细胞凋亡的影响

1～4：NC组、Zerumbone组、Zerumbone+pcDNA组、Zerumbone+pcDNA-Bcl-w组图9 Western印迹检测肝癌细胞Bcl-w、MMP-2、MMP-9、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表达

3 讨 论

肝癌是临床常见消化道恶性肿瘤之一，近年来，肝癌发病率逐年上升，由于肝癌恶性程度高及发展迅速导致患者预后较差，临床常采用手术与化疗等方法进行治疗，但患者易产生不良反应。研究表明部分中药在抗肿瘤方面发挥重要作用，并可通过调控癌细胞增殖及凋亡等生物学过程从而发挥抗肿瘤作用〔9，10〕。因此，本研究主要探究Zerumbone在肝癌发生及转移过程中的作用机制，为临床合理应用Zerumbone提供参考依据。

Zerumbone是从球姜中提取的化合物，其具有抗肿瘤、抗氧化应激等作用，研究表明Zerumbone可通过上调Bax的表达及下调Bcl-2的表达从而诱导胃癌细胞凋亡〔11〕。研究报道指出Zerumbone还可通过诱导细胞周期阻滞从而增强鼻咽癌细胞放射敏感性〔12〕。Zerumbone还可通过抑制黏着斑激酶(FAK)/蛋白激酶B(AKT)/Rho相关卷曲螺旋激酶(ROCK)信号通路的激活从而抑制肺癌细胞侵袭〔13〕。本研究结果显示Zerumbone可显著降低肝癌细胞活力，增加细胞凋亡率，提示Zerumbone可诱导肝癌细胞凋亡，抑制细胞增殖。研究表明CyclinD1可正向调控肝癌细胞周期，促进细胞增殖，caspase-3激活可促进细胞凋亡〔14，15〕。本研究结果显示Zerumbone可抑制CyclinD1的表达，Zerumbone可上调Cleaved caspase-3的表达。MMP-2、MMP-9可促进肿瘤浸润及转移〔16〕。本研究结果提示Zerumbone可抑制肝癌细胞的迁移及侵袭能力。miR-490-3p可能通过调控Smad2表达抑制结直肠癌细胞迁移及侵袭〔17〕。研究表明miR-490-3p可通过抑制转化生长因子β受体(TGFβR)1的表达从而抑制结肠癌细胞转移〔18〕。Bcl-w在甲状腺乳头癌组织中呈高表达，miR-133b可能通过负调控Bcl-w表达抑制甲状腺乳头癌细胞增殖及侵袭〔19〕。miR-203可能通过抑制Bcl-w的表达从而促进膀胱癌细胞凋亡〔20〕。本研究通过双荧光素酶报告实验证实Bcl-w是miR-490-3p的靶基因，miR-490-3p可靶向调控Bcl-w的表达。本研究结果显示，Bcl-w过表达可逆转miR-490-3p过表达对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用，Zerumbone可通过上调miR-490-3p及下调Bcl-w来抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，诱导细胞凋亡。

综上所述，Zerumbone可通过调控miR-490-3p/Bcl-w抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，并可促进细胞凋亡，阐述Zerumbone抗肝癌作用的部分作用机理，控制肝癌细胞转移可能是Zerumbone发挥抗肝癌作用的重要机制之一，为Zerumbone应用于肝癌的临床治疗提供实验依据。