miR-424介导的VEGFA低表达阻碍宫颈鳞状细胞癌侵袭和转移

万红英 王芬 张戈 俞茜 鲍梦欣

(1上饶市人民医院妇产科，江西 上饶 334000；2南昌大学第一附属医院妇产科)

宫颈癌是全世界女性中仅次于乳腺癌、结肠癌和肺癌的第四大癌症〔1〕。宫颈癌主要是由高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)基因型感染引起的〔2〕。随着宫颈癌筛查和预防的发展，如HPV联合检测和HPV疫苗接种，宫颈发育异常和癌症的早期诊断程序可降低宫颈癌的发病率和死亡率〔3〕。目前，对于宫颈癌患者的标准治疗指南是放疗联合顺铂类化疗，不幸的是，这些患者在最初的5年中有较高的复发率和较差的生存率〔4〕。大量的miR已被确定在各种肿瘤细胞生物过程中有重要作用，如细胞增殖、周期调控、细胞分化及细胞凋亡〔5〕。异常的miR表达参与宫颈癌的发病机制和进展，因此MicR有作为宫颈癌生物标志物的潜力〔6〕。已有研究表明miR-424对宫颈癌的诊断和预后有提示作用，抑制宫颈癌、子宫内膜癌细胞的生长、转移和浸润〔7〕。但miR-424对宫颈癌的具体作用机制尚未见报道，本研究旨在探讨miR-424介导的血管内皮生长因子(VEGF)A低表达对宫颈鳞状细胞癌的侵袭和转移的影响。

1 材料和方法

1.1试验动物 6只雄性SPF级别裸鼠，4～6周龄，体重(16±2)g，购自江西中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(赣)2018-0003。DMEM培养基(12100-046)、胎牛血清(10099-141)、胰蛋白酶(15050-057 )和青-链霉素(15140-122)均购自美国赛默飞世尔科技公司；CCK-8试剂盒(C0037)、LipoRNAiTM转染试剂(C0535)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)购自上海碧云天生物技术研究所；Transwell(3374)购自美国Corning公司；荧光素酶(L7840)检测试剂盒购自Solarbio公司；anti VEGFA(ab46154)、Ki67(ab15580)、PCNA(ab18197)、E-cadherin(ab15148)、N-cadherin(ab18203)、Vimentin(ab137321)购自英国Abcam公司。

1.2裸鼠移植瘤模型的建立〔8〕取处于对数生长的SiHa细胞，调整细胞为1×107个/ml，0.2 ml/只注射于裸鼠后背部靠近腋窝处皮下。达成瘤标准 (负荷瘤瘤径≥0.5 cm) 后将裸鼠随机分为两组：Scramble组和miR-424 agomir组。miR-424 agomir组第8天后开始注射miR-424 agomir，1次/4 d，每次1 nmol/L。

1.3肿瘤体积和重量 常规饲养接种肿瘤细胞的裸鼠30天，切除肿瘤，用10%甲醛固定，计算肿瘤体积。模型建立30 d后，切下肿瘤，称取各组裸鼠的肿瘤重量。

1.4方法

1.4.1qPCR 用Trizol法从各组SiHa细胞中提取总RNA，培养于37℃，5%CO2恒温培养箱中，使用逆转录试剂盒说明书合成cDNA，根据qPCR试剂盒说明书进行操作，反应条件为：95℃ 2 min，95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 15 s。miR-424以U6为内参，VEGFA以GAPDH为内参。用2-ΔΔCt法进行定量计算。

1.4.2免疫组化 取各组裸鼠肿瘤组织，常规石蜡包埋制成厚度约4 μm的切片，按免疫组化检测试剂盒说明书进行免疫组化染色，阳性表达为胞质出现棕黄色颗粒，采用光学显微镜观察Ki67和VEGFA在肿瘤组织中的表达情况。

1.4.3细胞培养与分组 正常宫颈细胞系Ect1/E6E7和宫颈癌细胞系Hela、C33A、SiHa购自美国典型培养物保藏中心，将细胞置于37℃，5%CO2恒温培养箱中用高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清和1 %青霉素-链霉素)培养，每3天更换1次培养基，收集细胞时用0.25%胰蛋白酶消化，试验选用对数生长期细胞。miR-424 mimic组采用LipoRNAiTM转染试剂将miR-424 mimic转染至SiHa细胞，LV-VEGFA转染LV-VEGFA载体，miR-424+VEGFA组同时转染miR-424 mimic和LV-VEGFA载体。

1.4.4荧光素酶报告实验 将NC-mimic、miR-424 mimic转染至SiHa细胞，将细胞分为3组：Control组、NC-mimic组和miR-424 mimic组，检测miR-424过表达情况。将LV-NC、LV-VEGFA转染至SiHa细胞，将细胞分为3组：Control组、LV-NC组和LV-VEGFA组，检测VEGFA过表达情况。通过生物信息学网站(http://www.targetscan.org/)显示VEGFA是miR-424-5p的潜在靶点，选用荧光素酶报告分析，构建野生型(Wt)和突变型(Mut)VEGFA 3′-UTR荧光素酶报告基因质粒，转染至SiHa细胞，将细胞分为4组：VEGFA Wt组、VEGFA Wt+miR-424-5p mimic组、VEGFA Mut组和VEGFA Mut+miR-424-5p mimic组，采用双荧光素酶报告基因试剂盒检测细胞荧光素酶相对活性。

1.4.5CCK-8 将SW480细胞接种于96孔板(100 μl/孔)孵育24 h后，按方法1.4.3分组处理各组细胞，每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育96 h，在450 nm处用酶标仪测定OD值。

1.4.6克隆形成法 将SiHa细胞接种至6孔板，约500个细胞每孔，按方法1.4.3进行处理及分组，培养7 d后弃掉上清液，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色15 min，洗净干燥后于显微镜下观察克隆形成数目，计算克隆形成率。细胞克隆形成率(%)=细胞克隆总数/接种细胞数×100%。

1.4.7Transwell 取无血清培养基稀释的人工基底膜，加入Transwell上室，37℃风干。取对数生长期的SiHa细胞，按方法1.4.3处理分组。上室中加入200 μl的细胞悬液，下室中加500 μl的含血清的DMEM培养基。37℃、5%CO2下培养24 h，棉签擦去基质胶和上室细胞，多聚甲醛固定后染色。光学显微镜下计数并拍照，每个样本随机选取5个视野。

1.4.8划痕法检测细胞迁移 将各组细胞制成1×106个/ml的细胞悬液，加入6孔板中。过夜培养至单层细胞。然后在单层细胞上用10 μl的枪头划横线，磷酸盐缓冲液(PBS)洗去脱落细胞。培养24 h后取出拍照测量划痕宽度，划痕愈合率0 h划痕宽度-24 h划痕宽度0 h划痕宽度。

1.4.9Western印迹 各组细胞加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。4℃下加入VEGFA、Ki67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin一抗(1∶1 000)孵育过夜，TBST清洗后加入HRP-IgG(1∶10 000)，加入电化学发光显色液显色。以GAPDH为内参，ImageJ软件分析各组细胞目的蛋白与GAPDH比值。

1.5统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析进行检验。

2 结 果

2.1miR-424抑制裸鼠移植瘤生长 第20天，第25天，第30天miR-424 agomir组肿瘤体积〔(145.15±56.12),(265.57±137.38),(637.54±183.38)mm3〕均显著低于scramble组〔(654.86±80.18),(1 233.43±124.24),(2 592.55±213.67)mm3,均P<0.05〕。30 d后，miR-424 agomir组肿瘤重量〔0.38±0.08)g〕显著低于Scramble组〔(0.82±0.13)g,P<0.05〕；miR-424 agomir组miR-424表达水平(0.16±0.05)显著低于Scramble组(1.28±0.14，P<0.01)；miR-424 agomir组Ki67、VEGFA阳性细胞数目〔(7.38±3.05)个、(4.15±1.02)个〕显著低于Scramble组〔(45.03±2.41)个、(32.33±1.81)个,P<0.01〕。见图1，图2。

图1 miR-424对裸鼠移植瘤生长的影响

图2 免疫组化检测Ki67和VEGFA表达(DAB，×200)

2.2miR-424与VEGFA靶向关系 与Ect1/E6E7组比较，SiHa组、Hela组、C33A组miR-424水平均显著降低，而VEGFA水平均显著升高(均P<0.05)。以SiHa组变化最显著。见表1。通过Targetscan预测得到VEGFA的3′-UTR有miR-424-5p的结合位点，提示VEGFA与miR-424-5p存在靶向作用关系。见图3。VEGFA Wt组荧光素酶活性(3.11±0.16)显著高于VEGFA Wt+miR-424-5p mimic组(2.02±0.37，P<0.05)；Control组miR-424表达水平(1.00±0.10)显著低于miR-424 mimic组(43.56±2.27，P<0.001)；Control组VEGFA表达水平(1.00±0.15)显著低于LV-VEGFA组(5.37±0.83，P<0.01)；与Control组VEGFA蛋白水平(1.00±0.18)比较，miR-424 mimic组(0.11±0.06)显著降低(P<0.05)，LV-VEGFA组(5.37±1.01)显著升高(P<0.01)，miR-424+VEGFA组VEGFA蛋白水平(0.73±0.26)显著低于LV-VEGFA组(P<0.05)。见图4。

表1 不同宫颈癌细胞系中miR-424、VEGFA表达水平比较

图3 Targetscan预测VEGFA与miR-424-5p靶向关系

1～4：Control组、miR-424 mimic组、LV-VEGFA组、miR-424+VEGFA组；图6、9同图4 Western印迹检测各组SiHa细胞VEGFA蛋白表达水平

2.3miR-424介导VEGFA低表达抑制宫颈癌SiHa细胞增殖 各组细胞增殖倍数均有时间依赖性(均P<0.05)。第1天，与Control组比较，miR-424 mimic组细胞增殖信数显著下降(P<0.05)。第2～4天，与Control组比较，miR-424 mimic组细胞增殖倍数均显著下降(均P<0.05)；LV-VEGFA组细胞增殖倍数均显著上升(均P<0.05)；miR-424+VEGFA组细胞增殖倍数均显著低于LV-VEGFA组(均P<0.05)。见表2,图5。与Control组比较，miR-424 mimic组克隆形成率显著下降(均P<0.05)；LV-VEGFA组显著上升(均P<0.05)；miR-424+VEGFA组克隆形成率显著低于LV-VEGFA组(均P<0.05)。见表3。与Control组Ki67、PCNA蛋白水平比较，miR-424 mimic组均显著降低(均P<0.05)，LV-VEGFA组均显著升高(均P<0.05)，miR-424+VEGFA组Ki67、PCNA蛋白水平均显著低于LV-VEGFA组(均P<0.05)。见表3，图6。

表2 各组SiHa细胞细胞增殖倍数比较

图5 克隆形成实验检测各组SiHa细胞克隆形成率(结晶紫染色，×200)

表3 各组SiHa细胞克隆形成率和Ki67、PCNA蛋白表达水平比较

图6 Western印迹检测各组SiHa细胞Ki67、PCNA蛋白表达

2.4miR-424介导VEGFA低表达抑制宫颈癌SiHa细胞侵袭和迁移 与Control组比较，miR-424 mimic组侵袭细胞数显著降低(P<0.01)，LV-VEGFA组侵袭细胞数显著升高(P<0.01)，miR-424+VEGFA组侵袭细胞数显著低于LV-VEGFA组(均P<0.05)。与Control组比较，miR-424 mimic组细胞迁移率显著降低(P<0.01)，LV-VEGFA组细胞迁移率显著升高(P<0.01)，miR-424+VEGFA组细胞迁移率显著低于LV-VEGFA组(均P<0.05)。见图7、图8、表4。

图7 Transwell检测各组SiHa细胞侵袭细胞数(结晶紫染色，×200)

图8 划痕法检测各组SiHa细胞划痕愈合率(×200)

表4 各组SiHa细胞侵袭细胞数、划痕愈合率比较

2.5miR-424介导VEGFA低表达抑制宫颈癌SiHa细胞EMT 与Control组相比较，miR-424 mimic组E-cadherin蛋白水平均显著升高(均P<0.05)，N-cadherin、Vimentin蛋白水平均显著降低(均P<0.05)，LV-VEGFA组E-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin蛋白水平显著升高(P<0.05)，miR-424+VEGFA组E-cadherin蛋白水平显著高于LV-VEGFA组(P<0.05)，LV-VEGFA组N-cadherin、Vimentin蛋白水平显著高于miR-424+VEGFA组(均P<0.05)，见图9，表5。显微镜下观察Control组较其他组上皮细胞有极性，细胞呈纺锤状，长出游离的丝状伪足，细胞排列疏松，失去细胞间的黏附力，细胞由上皮向间质转化，发生了典型的EMT形态变化，见图10。

图9 Western印迹检测各组SiHa细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平

表5 各组SiHa细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平比较

图10 各组SiHa细胞EMT形态学变化(免疫荧光，×200)

3 讨 论

宫颈癌是全世界女性中第四大最常见的肿瘤类型和第四大癌症死因〔9〕。miR-424-5p由miR-424前体5′端臂加工而成，在肿瘤细胞中的表达存在差异，如在胰腺癌、舌鳞状细胞癌等肿瘤细胞中高表达，而在肺癌、肝癌、宫颈癌等肿瘤细胞中低表达，有促癌或抑癌双重作用〔10〕。

VEGFA是一种糖基化的有丝分裂原，专门作用于内皮细胞，有多种作用，包括血管生成〔11〕。研究表明VEGF是肿瘤生长的正调节剂，可促进肿瘤迁移和侵袭并抑制肿瘤细胞凋亡〔12〕。Tao等〔13〕研究发现miR-144通过直接靶向VEGFA和VEGFC对宫颈癌细胞的生长、迁移和侵袭有抑制作用。本实验提示miR-424通过调控VEGFA的表达影响血管生成。

癌细胞过度增殖是宫颈癌病灶内重要的生物学特征，即抑制癌细胞增殖是治疗宫颈癌的必要方式。Ki67是存在于细胞增殖期的蛋白质，位于10号染色体上，与细胞增殖有关，在宫颈癌中呈现高表达〔14〕。PCNA是与细胞增殖周期相关的周期蛋白，应用免疫组化方法检测PCNA是研究肿瘤细胞增殖活性的常用方法，表达强意味着肿瘤细胞处于增殖期〔15〕。本研究表明miR-424抑制裸鼠肿瘤生长和宫颈癌SiHa细胞增殖。

超过90%的癌症相关死亡率是由远处转移而不是原发肿瘤引起的，癌症转移是一个复杂的过程，需要许多分子和细胞事件。判断肿瘤是否恶性与肿瘤细胞的侵袭程度相关。研究表明miR-424-5p参与肿瘤的侵袭和迁移，Wang等〔16〕研究发现miR-424-5p可通过负调节SMAD7参与上皮间质转化，从而参与食管鳞状细胞癌的侵袭和转移。Wu等〔17〕研究发现miR-424-5p表达上调可增加胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，同时抑制细胞凋亡。本研究提示miR-424可抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力。

EMT在肿瘤转移中起重要作用，在这个过程中，上皮细胞失去其特有的形态和功能特性，从而更接近间充质细胞，黏附特性和运动性发生改变〔18〕。EMT表型的普遍特征是在肿瘤发生过程中E-cadherin的功能丧失和N-cadherin、Vimentin过表达〔19〕。Zhang等〔20〕研究发现在肝癌细胞中过表达miR-424-5p直接靶向抑制β-连环蛋白/T细胞因子抑制子，维持细胞膜上E-cadherin/β-catenin复合物，可逆转失巢凋亡抵抗、阻止上皮间质转化、抑制迁移活性。本研究提示miR-424具有抑制宫颈癌SiHa细胞EMT的作用。

综上，miR-424可抑制裸鼠肿瘤生长，介导VEGFA低表达可抑制宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移及EMT。