姜黄素基于IL-8/MUC5ac信号通路对慢性阻塞性肺疾病大鼠的干预效果

2021-12-08 07:56周芳陈林蔡佳谭小武曾赛丽贾远航
中国老年学杂志 2021年23期
关键词:素组生物科技姜黄

周芳 陈林 蔡佳 谭小武 曾赛丽 贾远航

(南华大学衡阳医学院附属第二医院呼吸与危重症医学科,湖南 衡阳 421001)

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)是一种常见的肺部疾病,其主要特征为气流受限,并伴有气道和肺对有害气体所致的慢性炎症,呈现出不完全可逆、进行性受阻等特性。近年来,随着生活水平的不断提高,有害气体的增加,使其患病率逐年增加,造成严重的经济和社会负担〔1,2〕。有研究表明,病原微生物是导致慢阻肺主要原因之一,可直接导致肺损伤和呼吸黏膜受损〔3〕。但目前临床上慢阻肺的治疗效果并不理想,姜黄素属于一种多酚类物质,主要从姜黄根茎中提取获得,其具有较强的抗炎作用,并且其安全性较高,还原性较强〔4〕。有研究认为,其能够改善糖皮质激素抵抗〔5〕。但目前临床上对于姜黄素治疗慢阻肺机制并不明确,因此本研究探讨姜黄素治疗慢阻肺大鼠的疗效,为临床上姜黄素的应用提供新的依据。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物:选取SPF级40只SD健康大鼠,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,鼠龄(3.5±0.2)个月,体重(219.7±8.5)g。所有大鼠均养殖在干净笼子里,室温在(22.1±1.8)℃,相对湿度35%~40%,每天光照12 h,喂饮纯净水,饲养时间1 w。本研究所做实验获南华大学衡阳医学院附属第二医院伦理委员会批准。

主要试剂:姜黄素(河北天旭生物科技有限公司);盐酸氨溴索(湘潭嘉叶源生物科技有限公司);兔抗大鼠MUC5AC抗体(上海瑶韵生物科技有限公司);大鼠抗小鼠白细胞介素(IL)-8抗体(天津泰泽兴业生物科技有限公司);小鼠抗大鼠MUC5B抗体(上海士锋生物科技有限公司);人抗大鼠NE抗体(上海恪敏生物科技有限公司);兔抗大鼠转化生长因子(TGF)-α抗体(上海抚生实业有限公司)小鼠抗大鼠表皮生长因子受体(EGFR)抗体(武汉艾美捷科技有限公司);外源性白三烯(LT)B4酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海钰博生物科技有限公司)肺表面活性蛋白(SP)-D ELISA试剂盒(天津泰泽兴业生物科技有限公司);基质金属蛋白酶(MMP)-9 ELISA试剂盒、MMP-2 ELISA试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1分组、建模及给药 随机选取40只大鼠中10只作为正常组,其余大鼠参照钟莲娣等〔6〕方法建立慢阻肺模型,在实验1~15 d时使用2%的戊巴比妥溶液对大鼠进行麻醉,剂量50 mg/kg,在无菌的条件下进行颈中切口并分离气管,使用头皮针进行穿刺,气管内滴注1 g/L的LPS溶液2 mg/kg,注射后,对大鼠进行直立旋转2 min,使肺内药物分布均匀,缝合后正常饲养,该日不予烟熏。阳性对照组使用剂量为30 mg盐酸氨溴索皮下注射,2次/d;姜黄素组使用剂量为200 mg/kg姜黄素进行灌胃处理,1次/d;正常组和模型组不做任何处理。

1.2.2切片及染色 在给药干预1 w后随机选取各组中1只大鼠采用断头法处死,取肺组织,在含有4%的甲醛中固定24 h,石蜡包埋、切片、脱水,进行HE染色,在显微镜下观察肺组织病理变化。

1.2.3样本采集 抽取五组剩余9只大鼠颈总动脉血3 ml,在抗凝管中保存,用3 000 r/min的离心机离心,10 min后,将离心静脉血滴入EP试管中,分离上层血清,在-80℃环境下保存,待用。

1.2.4肺功能检测 将大鼠麻醉后,分离暴露气管,并在气管软骨处做环形切口,接入三通管,将气管和三通管固定后,使用RSE3020动物肺功能检测仪对用力肺活量(FVC)、呼气峰值流速(PEF)、第1秒用力呼气量进行检测。

1.2.5肺泡灌洗液白细胞数目及分类统计 待肺功能完成后,将三通管去除后,切开胸部,对右肺门进行结扎处理,将5 ml的生理盐水注入左肺中,进行3次冲洗,进行回收,并离心弃上清,加入200 μl PBS,进行细胞沉淀,震荡均匀后,取20 μl,在显微镜下对细胞总数进行计算。剩余细胞液制备细胞涂片,待干后进行染色,并在显微镜下对200个细胞中巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数目进行统计,计算其比率。

1.2.6LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平检测 采用ELISA对LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平进行检测。

1.2.7IL-8/MUC5ac通路蛋白检测 Western印迹检测IL-8/MUC5ac通路中MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR通路蛋白,提取大鼠肺组织中的样品总蛋白,将其与上样缓冲液按比例混合,煮沸5 min后,进行电泳,并将蛋白电泳转至PVDF膜,使用5%的脱脂奶粉封闭1~2 h,然后加入一抗溶液TBST(MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR按照1∶1 000稀释),在4℃条件下进行震荡过夜,再次洗涤,放入二抗溶液TBST(MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR按照1∶5 000稀释),室内震荡120 min后,洗涤,显色成像,使用软件分析蛋白条带灰度值。内参蛋白是GAPDH。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行F检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1病理组织学观察 正常组肺泡、纤毛形态正常,结构完整;模型组上皮细胞大量脱落,肺泡壁变薄并破裂;阳性对照组上皮细胞部分脱落,肺泡壁变薄;姜黄素组上皮细胞脱落不明显,肺泡融合。见图1。

图1 各组肺组织病理形态学(HE,×200)

2.2各组肺功能比较 如表1所示,模型组、阳性对照组、姜黄素组FVC、PEF、FEV1均低于正常组,具有统计学差异(P<0.05);阳性对照组、姜黄素组FVC、PEF、FEV1均高于模型组,具有统计学差异(P<0.05);姜黄素组FVC、PEF、 FEV1均高于阳性对照组,具有统计学差异(P<0.05)。

表1 各组肺功能比较

2.3各组肺泡灌洗液白细胞数目及分类比较 如表2所示,模型组、阳性对照组、姜黄素组白细胞数、中性粒细胞比率高于正常组,且巨噬细胞、淋巴细胞比率低于正常组,具有统计学差异(P<0.05);阳性对照组、姜黄素组白细胞数、中性粒细胞比率低于模型组,且巨噬细胞、淋巴细胞比率高于模型组,具有统计学差异(P<0.05);姜黄素组白细胞数、中性粒细胞比率低于阳性对照组,且巨噬细胞、淋巴细胞比率高于阳性对照组,具有统计学差异(P<0.05)。

表2 各组肺泡灌洗液白细胞数目及分类、血清中LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平比较

2.4各组血清中LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平比较 模型组、阳性对照组、姜黄素组LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平均高于正常组,具有统计学差异(P<0.05);阳性对照组、姜黄素组LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平均低于模型组,具有统计学差异(P<0.05);姜黄素组LTB4、SP-D、MMP-2、MMP-9水平均低于阳性对照组(P<0.05)。见表2。

2.5各组肺组织中IL-8/MUC5ac信号通路蛋白表达量比较 如图2、表3所示,模型组、阳性对照组、姜黄素组MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表达量均高于正常组,具有统计学差异(P<0.05);阳性对照组、姜黄素组MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表达量均低于模型组,具有统计学差异(P<0.05);姜黄素组MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表达量均低于阳性对照组,具有统计学差异(P<0.05)。

图2 各组肺组织中IL-8/MUC5ac通路蛋白MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表达

表3 各组肺组织中IL-8/MUC5ac信号通路蛋白表达量比较

3 讨 论

慢阻肺属于一种慢性气道炎症疾病,其可导致黏液分泌增加,而致使炎症加重。慢阻肺其特点为不完全可逆、呈进行性发展等,其与肺部有害气体和有害颗粒有关〔7〕。慢阻肺主要是由气道、肺血管等发生炎症病变而导致,当肺部中的肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞等聚集时,会导致气道病变,并促使肺损伤。赵春柳等〔8〕研究认为,呼吸道病毒感染在慢阻肺急性加重期常见,发热是常见症状;稳定期呼吸道症状严重者对病毒易感,呼吸道病毒感染导致系统性炎症水平升高,流感病毒显著。

姜黄素具有较好的抗炎、抗氧化、抗癌等功能,属于一种多效天然物质。其能够通过抑制脂肪氧化酶、肿瘤坏死因子等发挥其疗效,能够改善关节炎、心肌炎等多种炎性疾病〔9〕。姜黄素能够通过抗氧化而清除自由基、抗炎性反应、调脂等,起到防止动脉粥样硬化作用。栾春雨等〔10〕研究中认为,姜黄素和布地奈德合用大鼠肺组织中IL-8、TNF-α、MMP-9等的表达量明显降低,并与HDAC2的表达量呈负相关,这种相关性可能与大鼠肺组织的IL-8、MCP-1、TNF-α、MMP-9启动子区与HDAC2的结合水平有关。说明姜黄素可能通过升高HDAC2的表达量和活性,增强慢阻肺大鼠对糖皮质激素的敏感性及抗炎作用。因此本研究中,建立慢阻肺模型大鼠进行治疗,结果显示,模型组大鼠肺功能低于正常组,阳性对照组和姜黄素组大鼠肺功能高于模型组,且姜黄素组大鼠肺功能高于阳性对照组,此结果说明,姜黄素可有效改善肺功能,效果显著。

LTB4属于花生四烯酸的代谢产物,在炎性刺激下,各类炎症细胞均可产生LTB4。有研究表明,其能够通过巨噬细胞和嗜酸性粒细胞等释放,并参与慢阻肺等气道炎症过程,均有较强的炎症作用〔11〕。SP-D属于一种促炎性因子,当机体受到炎症侵袭时,其水平显著提高。刘海平等〔12〕研究认为,呼出气冷凝液(EBC)和血清中SP-D、趋化因子(CCL)18表达变化在慢阻肺急性加重病情监测中具有一定价值,而且EBC中SP-D、CCL18表达变化在慢阻肺急性加重患者病情监测中更具独特的优势。MMP-2和MMP-9均属于MMP家族中的一员,MMP属于蛋白水解酶的一种,在慢阻肺的发病机制中发挥着重要作用,当MMP表达过多时,会直接导致肺部炎症和肺实质损伤〔13,14〕。本研究结果说明,姜黄素可有效改善慢阻肺大鼠炎症水平,效果显著。

IL-8能够通过与气道表面IL-8受体结合,趋化气道表面细胞,活化MUC5AC黏蛋白,促发炎症。MUC5AC是由气道杯状细胞和黏膜下腺分泌,主要存在于气道表面上皮细胞层,能够被各种因素所影响,是人类呼吸道分泌较多且紧密相关的黏蛋白〔15〕。IL-8属于多源性细胞因子,能够促进炎症反应,是一种重要的炎症介质,有研究表明,其可在TGF-α和IL-1的诱导下释放〔16〕。MUC5B属于黏蛋白的一种,主要产生于呼吸道〔17〕。NE也称为中性粒细胞弹性蛋白酶,其能够聚集炎症因子,且能够加速气道的破坏和肺组织的损伤〔18〕。TGF-α在细胞外基质调节中发挥着重要作用,并且在细胞外基质中起到抑制和沉淀的作用,有研究表明,TGF-α能够通过抑制蛋白水解酶、胶原酶原等起到降解细胞外基质的表达〔19〕。EGFR属于ErbB家族中的一员,主要存在于上皮细胞、成纤维细胞等细胞表面,属于酪氨酸激酶型受体〔20〕。本研究结果说明,姜黄素可有效改善慢阻肺大鼠肺组织MUC5AC、IL-8、MUC5B、NE、TGF-α、EGFR蛋白表达量,效果显著。

综上所述,姜黄素能明显改善慢阻肺大鼠肺损伤程度,降低炎症水平,其机制可能与IL-8/MUC5ac通路受到抑制有关,为临床上治疗慢阻肺等其他炎症病症提供了新的方向。

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