健脾固肾化瘀汤对糖尿病肾病大鼠CTGF及podocin的影响

吕树泉 张淑芳 王元松 苏秀海

(河北中医学院附属沧州中西医结合医院内分泌糖尿病科，河北 沧州 061001)

糖尿病肾病是糖尿病临床上常见的并发症之一，其主要特征表现为肾小球肥大、肾小球和肾小管基底膜增厚、肾小管间质纤维化等，糖尿病肾病是导致肾衰竭的重要原因〔1〕。有研究表明，糖尿病肾病的发病机制与多种细胞因子及氧化应激等因素有关。临床上通常以药物进行治疗，西药起效快，但西药会对机体产生不同程度的损伤〔2〕。中药历史悠久，对于糖尿病肾病的治疗有重要意义，有学者认为，健脾固肾化瘀汤有降低血清三酰甘油、总胆固醇、肌酐、尿素氮、24 h尿微量白蛋白、转化生长因子(TGF)-β1、α-金属硫蛋白(MT)-1、α-肌动蛋白(SMA)、微管轻链Ⅰ蛋白3-Ⅱ型(LC3-Ⅱ)、Beclin等指标水平的作用,对肾组织病理改变有改善和保护作用〔3〕。因此本研究运用健脾固肾化瘀汤对糖尿病肾病大鼠进行治疗，为临床上健脾固肾化瘀汤的应用提供了新的循证参考。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物：选取SPF级60只SD健康大鼠，由中国医学科学院放射医学研究所提供，动物合格证号：11401300065459，单位许可证号：SYXK(津)2014-0002，鼠龄(3.9±0.3)个月，体重(227.7±10.8)g。所有大鼠养殖在干净笼子里，室温在(22.1±1.8)℃，相对湿度35%～40%，每天光照12 h，喂饮纯净水，饲养时间1 w。本研究获得医院伦理委员会批准。主要试剂：健脾固肾化瘀汤(北京康仁堂药业有限公司)；大鼠抗小鼠胰岛素样生长因子(IGF)-1 mRNA抗体(北京百奥莱博科技有限公司)；兔抗小鼠结缔组织生长因子(CTGF)抗体、C-C型趋化因子配体(CCL)5 试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司)；人抗大鼠肾小球足细胞裂隙膜蛋白(podocin)抗体(厦门研科生物技术有限公司)；大鼠抗兔肾小球足细胞nephin mRNA抗体及兔抗大鼠核转录因子(NF)-κB抗体(上海科敏生物科技有限公司)；超敏C反应蛋白(hs-CRP)试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1分组、建模及给药 随机选取60只大鼠中10只作为正常组，剩余50只大鼠采用链脲佐菌素(STZ)〔4〕诱导建立糖尿病肾病大鼠模型，造模前，所有大鼠禁食12 h，腹腔一次性注射STZ(65 mg/kg)，STZ使用枸橼酸钠缓冲液(0.1 mol/L,pH=4.5)进行配制，须在10 min内使用完；72 h后，取尾静脉血测空腹血糖(FPG)，连续3次，取其平均值，当FPG>16.7 mmol/L提示造模成功，成功率为70%，去除未成功建模大鼠。建模成功后，均在12 h后开始给药，雷米普利组使用雷米普利片进行灌胃，0.001 g/kg，1次/d；健脾固肾化瘀汤是由黄芪、西洋参、白术、山药、芡实、金樱子、山茱萸、熟地黄、当归、丹参、水蛭、茯苓、酒大黄组成，按比例加入纯净水制成混悬液，然后对低、中、高剂量组进行灌胃处理，1次/d，使用剂量分别为：1.9 g/kg、3.8 g/kg、7.6 g/kg；正常组与模型组以同等剂量的生理盐水进行灌胃，1次/d，连续8 w。

1.2.2样本采集 所有大鼠在给药8 w后，静脉采血后处死，离心半径5 cm、3 000 r/min离心处理10 min，分离上层血清，-80℃保存，待用。

1.2.3切片及染色 取肾脏组织，4%多聚甲醛固定、脱水透明，浸蜡包埋，脱蜡、苏木素-伊红(HE)染色，之后脱水、透明，切片厚度为4 μm，待封片晾干后在显微镜下观察大鼠肾脏组织病理学表现。

1.2.4生物化学检测 使用全自动生化分析仪对尿素、肌酐、三酰甘油、总胆固醇进行检测；酶联免疫吸附试验对24 h尿蛋白进行检测，取50 mmol/L碳酸盐缓冲液对24 h尿蛋白、CCL5、hs-CRP进行稀释，加入聚苯乙烯的反应孔中，加盖处理后，在4℃下置留24 h，次日洗涤3次后，抛干，在每孔中均加入稀释液(pH值为7.4，0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液)稀释待测标本0.1 ml，加入阳性、阴性对照标本，在42℃下置留60 min，将液体移除并洗涤3次后，抛干，在每孔中加入24 h尿蛋白、CCL5、hs-CRP抗体0.1 ml，再次置留60 min，将液体移除并洗涤3次，抛干，并在每孔中加入低物液(0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸橼酸)混匀，且加入0.1 ml邻苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L H2SO40.05 ml放置各孔内，终止反应。使用酶标仪检测A450，分析24 h尿蛋白、CCL5、hs-CRP水平。采用罗氏Accu-Chck血糖检测仪对FPG进行检测。

1.2.5IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表达检测 RT-聚合酶链反应(PCR)对IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表达进行检测，严格按照定量PCR仪的操作说明书进行。依次加入2.5 μl稀释10倍的PCR缓冲液，1.5 μl MgCl2溶液，0.5 μl上游引物和下游引物，最后加水配成总体积25 μl的反应体系。94℃ 1 min；55℃ 1 min；72℃ 1 min，进行35个循环，72℃ 5 min，重复最少3次。采用2-△△Ct方法计算出需要检测的IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表达水平。IGF-1 mRNA引物序列：上游cDNA 为模板、GAPDH 为内参照，用以下引物(上游:5′-CCAGTCACATCCTCCTCG-3′；下游：5′-TACATCTCCAGCCTCCTCA-3′)；nephrin mRNA引物序列：上游cDNA 为模板、GAPDH 为内参照，用以下引物(上游:5′-CCCTGCCTCTGTCTTCTCTG-3′；下游：5′-GGTGGTCTTCTGCTGCTCTC-3′)。

1.2.6CTGF、podocin、NF-κB蛋白表达检测 使用免疫组化染色对CTGF、podocin、NF-κB蛋白表达进行检测，将二甲苯更换放置10 min后进行酒精水化，加入蛋白酶修复液，进行孵化30 min，温度为：37℃，弃抗原；将切片移至湿盒中，加入3%H2O2，恒温冰箱孵育10 min，使用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗；再次加入山羊血清，常温下封闭30 min，使用滤纸将封闭液吸取，加入一抗，放入湿盒，再次加入二抗，孵育1 h，进行PBS冲洗，经过二氨基联苯胺(DAB)显色处理10 min，观察棕黄色阳性反应，采用PBS冲洗1 min；使用苏木素染色3 min，使用浓度为1%的盐酸乙醇进行分化处理，使用自来水冲洗1 min，脱水、封片处理。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.1病理组织学观察 与正常组相比，模型组肾小球血管壁狭窄，肾小球上皮细胞变性，肾小管周围明显炎症侵蚀；雷米普利组肾小管血管壁有所改善，仍伴有炎性细胞；低、中、高剂量组肾组织明显改善，且高剂量组最为明显。见图1。

图1 各组肾组织病理组织学观察(HE，×400)

2.2各组尿素氮、肌酐、三酰甘油、总胆固醇、24 h尿蛋白水平比较 与正常组相比，其余各组尿素氮、肌酐、三酰甘油、总胆固醇、24 h尿蛋白水平均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，雷米普利组、低剂量组、中剂量组、高剂量组尿素氮、肌酐、三酰甘油、总胆固醇、24 h尿蛋白水平均显著降低(P<0.05)；与雷米普利组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组尿素氮、肌酐、三酰甘油、总胆固醇、24 h尿蛋白水平均显著降低，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见表1。

表1 各组尿素氮、肌酐、三酰甘油、总胆固醇、24 h尿蛋白水平比较

2.3各组FPG、CCL5、hs-CRP水平比较 与正常组相比，其余各组FPG、CCL5、hs-CRP水平均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，雷米普利组、低剂量组、中剂量组、高剂量组FPG、CCL5、hs-CRP水平均显著降低(P<0.05)；与雷米普利组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组FPG、CCL5、hs-CRP水平均显著降低，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见表2。

表2 各组FPG、CCL5、hs-CRP水平比较

2.4各组肾皮质IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表达水平比较 与正常组相比，其余各组IGF-1 mRNA水平显著升高，而nephrin mRNA水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，雷米普利组、低剂量组、中剂量组、高剂量组IGF-1 mRNA水平显著降低，而nephrin mRNA水平显著升高(P<0.05)；与雷米普利组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组IGF-1 mRNA水平均显著降低，而nephrin mRNA水平均显著升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图2，表3。

1～6：正常组，模型组，雷米普利组，低剂量组，中剂量组，高剂量组图2 RT-PCR检测各组IGF-1 mRNA、nephrin mRNA的表达

表3 各组肾皮质IGF-1 mRNA、nephrin mRNA表达水平比较

2.5各组CTGF、podocin、NF-κB蛋白表达水平比较 与正常组相比，其余各组CTGF、NF-κB蛋白表达水平显著升高，而podocin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，雷米普利组、低剂量组、中剂量组、高剂量组CTGF、NF-κB蛋白表达水平显著降低，而podocin蛋白水平显著升高(P<0.05)；与雷米普利组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组CTGF、NF-κB蛋白水平显著降低，而podocin蛋白水平显著升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图3，表4。

图3 各组肾组织中CTGF、podocin、NF-κB免疫组化染色(DAB，×400)

表4 各组CTGF、podocin、NF-κB蛋白表达水平比较

3 讨 论

糖尿病肾病是导致肾衰竭的主要原因之一，其病情隐匿，早期无明显症状，一旦发现，已进入临床期，主要表现为蛋白尿、渐进性肾功能损害、高血压、等病理特征〔5〕。其发病机制尚不明确。中医上将其归为“水肿”“尿浊”等范畴，迁延日久，导致阴阳两虚，脾肾衰弱〔6〕。早期糖尿病肾病病位在脾，脾气亏虚，机体失养则疲倦乏力，脾虚日久，后天失养，累及先天，肾气亏虚则小便短少，或夜尿频多；脾肾气虚，固摄失权，精微漏出，则尿浊〔7〕。

健脾固肾化瘀汤重用黄芪，味苦甘，性微温，益气健脾，消肿利尿，补诸虚不足，补齐力强且能生阳；西洋参补气养阴；熟地黄、山茱萸、山药均有补虚益肾之用；芡实、金樱子、五味子固精益肾；白术益气健脾，茯苓利水淡渗，两者合用，能够利水湿从小便去；当归养血活血；丹参、酒大黄、水蛭能活血化瘀〔8〕。全方诸药使用，标本兼顾，共奏健脾固肾、化瘀通络之功。

FPG主要用于检测血糖浓度〔9〕。CCL5是一种分泌性蛋白，属于CC家族中的一员，且参与调节免疫的过程。CCL5在多个细胞中均有表达，其中包括脂肪细胞、角膜基质细胞、血小板等〔10〕。hs-CRP是一种急性相反应蛋白，主要通过肝细胞分泌，并且受多种炎性因子的调控和诱导〔11〕。有研究表明，hs-CRP炎性反应时，可通过促进尿蛋白漏出增加糖尿病肾病的发生。hs-CRP不仅能调节炎症反应，还是炎症反应的重要生化指标〔13〕。本研究结果说明健脾固肾化瘀汤可一定程度减轻糖尿病肾病大鼠炎性因子水平，降低血糖，且呈剂量依赖。

IGF-1能促进细胞生长，且能促进细胞分化、增殖等。研究表明IGF-1是一种有代谢效应的细胞因子，并且在生长发育中发挥着重要作用〔14,15〕。在糖尿病肾病中，高血糖致使细胞严重缺氧损伤，导致肾脏局部IGF-1旁分泌增高，降解减少，从而导致IGF-1水平升高。IGF-1还能通过诱导肾脏激肽释放酶激活，致使肾小球血流改变。nephrin属于肾小球的滤过屏障，其一共分为3层，是最早发现的一种裂孔隔膜蛋白，能维持关键裂空隔膜蛋白分子，是检测肾小球损伤的重要标志物〔16，17〕。本研究结果说明健脾固肾化瘀汤在一定程度上可改善糖尿病肾病大鼠IGF-1、nephrin的表达，效果显著，且呈剂量依赖。

CTGF广泛存在于体内，在各个器官和细胞内均有表达，但广泛存在于肾组织中，生理状态下，肾小球分泌较少的CTGF，但在机体出现纤维化时，其水平会显著升高〔18〕。CTGF能促进细胞的增殖和成纤维细胞的聚集等，促进胶原和黏蛋白的合成。podocin是一种跨膜蛋白，是Sto-matin家族的一员，主要存在于肾组织中〔19〕。NF-κB是一种与炎症作用产生、细胞增生和细胞凋亡等相关的转录因子。NF-κB的活化能够使细胞因子和外基质上调。NF-κB是一种介导细胞的转绿因子，是由p50和p65两个多肽链组成。当细胞静息条件下，其处于失活状态，当细胞受到刺激时，IκB与NF-κB迅速分离，进入细胞核内，参与基因转录，因此在机体的免疫应答、炎症反应和细胞生长发育中发挥着重要作用〔20〕。本研究结果说明健脾固肾化瘀汤可在一定程度上改善糖尿病肾病大鼠CTGF、podocin、NF-κB表达，效果显著，且呈剂量依赖。

综上，健脾固肾化瘀汤有降低尿素氮、肌酐、三酰甘油、总胆固醇、24 h尿蛋白定量、CCL5、hs-CRP等水平的作用，对肾组织病理改变有改善和保护作用。