1株重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及序列分析

董建国 ， 饶 丹 ， 刘 涛 ， 胡 静 ， 何书海 ， 焦凤超 ， 陈 斌 ， 黄 立 ， 赵攀登

(1. 信阳农林学院牧医工程学院 ， 河南 信阳 464000 ； 2. 河南牧业经济学院动物医学院 ， 河南 郑州 450046)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种对养猪业危害严重的传染病，该病的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)。PRRSV的基因型分为两类(I型、II型),在欧洲流行的以Lelystad virus (LV)为代表的毒株归为I型 ； 在北美流行的以VR-2332为代表的毒株归为II型，这2种毒株之间全基因组同源性仅为60%，抗原性也有很大差异[1-2]。我国首先分离到的PRRSV毒株为CH-1a[3]，2006年高致病性毒株在我国暴发，造成了严重的经济损失[4]。近年来又流行了NADC30-like毒株。由于PRRSV的毒株较多、变异性强等特性，给该病的防控带来严峻的挑战，因此掌握PRRSV的遗传演化规律对防控PRRS十分关键。为了进一步了解广东地区PRRSV流行毒株的遗传特性，本试验在该地区分离到了PRRSV毒株，并对其全基因组进行了测序分析，掌握了该毒株的遗传演化特性，为广东地区PRRSV的防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 病料与主要试剂 样品采自广东省某疑似暴发PRRS的猪场，采集发病猪的肺部病变组织，置于-80 ℃ 备用。Marc-145 细胞为本试验室保存；病毒DNA/RNA 提取试剂盒、Trans-5α感受态细胞、RT-PCR 相关试剂盒、胶回收试剂盒和DL2 000 DNA marker，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 引物设计与合成 根据GenBank中收录的PRRSV代表毒株全基因组序列，设计出1对扩增GP5基因的鉴定引物(GP5F：5′-GTGTCAGGCATTGTGGCTGTG-3′;GP5R:5′-CATTATTGGCATGTAGGTGATAGAAAA-3′)和13对特异性引物用于扩增全基因组序列，引物由金维智有限公司合成。引物信息见表1。

表1 PRRSV全基因组扩增引物Table 1 Amplification primers of PRRSV whole genome

1.3 病料处理 将采集的病变组织剪碎，混合1 mL 的PBS在4 ℃环境下充分研磨，组织研磨液，10 000 r/min 离心10 min，收集上清液，用0.22 μm微孔滤器过滤除菌，得到的滤液置于-20 ℃保存。

1.4 病毒分离及间接免疫荧光试验 Marc-145传至6孔板培养，每个样品1个重复，待细胞长满后弃去培养液，用PBS清洗3次，随后接种100 μL含病毒的滤液，加入100 μL 不含血清含2%双抗的DMEM培养液，37 ℃培养1 h，弃去上清，加入含5%血清的DMEM维持液2 mL，置于细胞培养箱中培养3～5 d，观察细胞是否出现明显细胞病变效应(CPE)，如果有80%细胞出现CPE，就将该细胞液收集置于-80 ℃冰箱保存备用。为了进一步鉴定出现CPE的细胞感染了PRRSV，同时将做的重复孔细胞用无水乙醇固定20 min，PBS洗涤3次，每次3 min； 加入抗PRRSV N蛋白单克隆抗体，室温孵育1 h；PBS洗涤3次，每次3 min；加入FITC标记的二抗，避光，室温孵育1 h；PBS洗涤3次，每次3 min；加入荧光猝灭剂，制作片子并在荧光显微镜下观察。

1.5 全基因组扩增及测序 收取培养至第3代的病毒，根据核酸提取试剂盒说明书操作提取病毒核酸，然后运用反转录试剂对病毒核酸进行反转录。将反转录得到的cDNA作为模板进行基因扩增，反应条件:94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min， 扩增30个循环；72 ℃ 7 min。取5 μL 的PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，选取目的片段按照胶回收试剂盒说明书进行回收，得到的样品连接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 上，转化至感受态细胞，挑菌鉴定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.6 基因组序列对比分析 利用Lasergene 及Mega 5.0 软件对分离的GDhd毒株进行全基因组序列拼接，将得到的GDhd全基因组与国内外分离毒株进行序列比对并构建进化树，同时构建Nsp2基因和GP5基因的进化树，PRRSV代表毒株的基因序列均下载自GenBank。

2 结果

2.1 病料样品的RT-PCR检测 将病料提取的核酸作为模板，进行扩增，然后用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果显示，扩增片段大小符合预期结果(833 bp)，同时阴性对照的RT-PCR检测结果显示为阴性(图1)。

图1 PRRSV GDhd ORF5片段扩增Fig.1 Amplification of PRRSV GDhd ORF5 geneM：DNA分子质量标准 DL2 000； 1：样品； 2：阴性对照M:DNA marker DL2 000; 1：Sample; 2:Negative control

2.2 病毒分离培养及鉴定 病料处理液接种Marc-145细胞后连续培养观察3～5 d，待细胞出现聚集、皱缩并脱落等明显CPE时，进行间接免疫荧光鉴定，结果显示，接种病料组出现特异性的绿色荧光，证明病毒分离成功(图2)。

图2 PRRSV GDhd在Marc-145细胞上的病变结果(100×)Fig.2 Cytopathic effect of PRRSV GDhd on Marc-145 cell (100×)A：正常细胞(荧光)； B：正常细胞(白光)； C:病变细胞(荧光)； D：病变细胞(白光)A:Normal cells (Fluorescence); B:Normal cells (White light); C:Pathological cells (Fluorescence); D:Pathological cells (White light)

2.3 全基因组扩增及测定 运用设计的特异性引物，对GDhd基因组不同片段进行特异性扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示，成功扩增出13个片段，片段大小符合预期。将扩增出的片段胶回收连接载体测序，结果显示，每个片段均测通，且均是PRRSV序列。对13个序列进行拼接得到全长为15 377 bp 的PRRSV全基因组序列，毒株命名为GDhd(图3)。

图3 PRRSV GDhd 13个基因片段的RT-PCR扩增结果Fig.3 RT-PCR amplification result of 13 gene fragments from PRRSV GDhd M：DNA marker DL2 000； 1～13：PRRSV GDhd 13个片段的扩增M:DNA marker DL2 000; 1-13:13 fragments amplified from PRRSV GDhd

2.4 GDhd全基因组遗传演化分析 用Mega 5.0 软件将GDhd毒株与GenBank上收录的其他具有代表性的PRRSV毒株构建进化树。结果显示，PRRSV主要分为2个大分支，即以Lelystad virus 为代表的欧洲型和以VR2332 为代表的美洲型，美洲型毒株又可细分出以美国NADC30毒株为代表的分支、以CH-1a为代表的我国低致病毒株分支以及以JXA1、HN4为代表的高致病毒株分支(图4)。结果表明，GDhd株与我国高致病毒株同属一个分支，与JXA1、HuN4、JXwn06等同源性较高。

图4 PRRSV GDhd全基因组的进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of PRRSV GDhd whole genome●：本试验分离的毒株●:The strains isolated in this test

2.5 GDhd全基因组同源性分析 用DNASTAR软件将GDhd与其参考毒株的序列对比，结果显示，GDhd与HuN4同源性最高，为95.6%，与其高致病毒株JXA1、JXwn06同源性为95.4%和95.5%，与NADC30 和NADC30-like毒株 JL580、CHsx1401 同源性分别为86.5%、88.9% 和85.4%，与美洲型代表株VR-2332 同源性为88.2%，与欧洲型代表株Lelystad virus 同源性仅为60.1%(图5)。

图5 PRRSV GDhd全基因序列比对Fig.5 Sequence alignment of PRRSV GDhd whole genome

2.6 编码Nsp2和GP5蛋白的基因序列的进化分析 分别用GDhd编码Nsp2和GP5蛋白的基因序列与参考毒株的对应基因序列对比分析构建进化树。结果如图6显示，GDhd和JL580在Nsp2编码区同属一个分支，GDhd和JXA1在GP5编码区处于同一分支。结果表明，GDhd毒株可能是1株重组毒株。

图6 PRRSV GDhd Nsp2和GP5基因遗传进化树分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of PRRSV GDhd Nsp2 and GP5 genesA：PRRSV Nsp2基因进化树分析； B：PRRSV GP5基因进化树分析A:Phylogenetic tree analysis of PRRSV Nsp2 gene; B:Phylogenetic tree analysis of PRRSV GP5 gene●：本试验分离的毒株●:The strains isolated in this test

2.7 GDhd的重组分析 利用生物信息学软件对GDhd毒株进行同源性分析。结果显示，GDhd存在重组现象，重组位点位于全基因组第1 310位点和第3 672位点，2个位点将GDhd分为3个区域，1区和3区与JXA1亲缘关系较近，2区与NADC30亲缘关系较近(图7)。发生重组的2区主要位于PRRSVNsp2编码区，GDhd毒株在Nsp2编码区与NADC30株同源性较高，这些结果表明GDhd是JXA1与NADC30的重组毒株，重组区域发生在Nsp2编码区。

图7 PRRSV GDhd重组分析Fig.7 Recombinant analysis of PRRSV GDhd

3 讨论

我国流行的PRRSV毒株主要是北美VR-2332的演化毒株，首次分离到的CH-1a毒株与VR-2332的全基因组序列差异较大，目前尚没有充足的证据证明其来源，随后分离到的BJ-4毒株与VR-2332同源性较高[5]，可能是通过引进种猪传入我国。2006年，高致病性PRRS在我国流行，引起猪高发病率、高死亡率以及妊娠母猪繁殖障碍等，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。分离到的毒株主要以JXA1、HuN4为代表，在Nsp2编码区存在30个不连续的氨基酸缺失[6-7]。近年来，我国又流行与美国NADC30相似的毒株，被命名为NADC30-like毒株[8]，主要代表毒株有JL580和CHsx1401，与VR-2332毒株相比Nsp2在aa324～434、aa486和aa505～523存在131个不连续的氨基酸缺失。

为了解广东地区PRRSV流行毒株的遗传变异特性，本试验从广东某疑似PRRS发病猪场采集病料，并成功分离到PRRSV毒株，命名为GDhd。随后测定了该毒株的全基因组序列并与其他参考毒株进行比对分析，结果表明，该毒株与HuN4同源性最高，为95.6%，属于高致病性毒株；GDhdNsp2基因进化分析发现，GDhdNsp2和JL580Nsp2 在同一分支。重组分析显示，GDhd毒株在Nsp2编码区与NADC30株同源性较高，其他区域与JXA1同源性较高。这些结果表明，GDhd毒株是一种JXA1与NADC30重组的毒株，重组区域主要位于Nsp2编码区。近些年来，重组的毒株也被越来越多的报道，不同类型之间的毒株存在广泛重组现象，如lineage 1,3，5和8毒株之间重组[9-10]，NADC30和疫苗毒株 JXA1-P80的重组[11]，并且研究显示，重组产生的新毒株感染宿主后导致低中和抗体水平，致使猪更容易发病[12]。通过对2014—2018年的中国和美国毒株基因组分析显示，PRRSV重组位点主要位于nsp9,GP2和GP3区域[13]，研究显示，重组是PRRSV毒株变异的重要原因[14]。本试验结果表明，Nsp2在基因重组中具有重要作用，是否与毒株的致病性有关需要进一步研究。

重组毒株可表现出不同的毒力及免疫原性，市场上的商品化疫苗对这类毒株常常缺乏保护，这也加剧了PRRS的防控难度。重组毒株的出现增加了PRRSV的多样性，对流行毒株遗传特性的研究对于新疫苗的研发十分重要，本试验通过对广东流行毒株GDhd进行分离鉴定及遗传特性分析，为研究重组毒株的重组特性及疫苗的研发提供了参考依据。