云南大理野鼠毕氏肠微孢子虫分子流行病学调查

庄尔俊 ， 王琪琪,2 ， 赵俊杰 ， 岳凤娇 ， 李海龙,3

(1.大理大学基础医学院 ， 云南 大理 671000 ； 2.山西医科大学晋祠学院 ， 山西 太原 030000 ； 3.云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室 ， 云南 大理 671000)

微孢子虫(Microsporidia)是一种专性胞内寄生的人兽共患寄生虫，呈世界性分布[1]。其中毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoonbiebeusi，E.biebeusi)是最常见的微孢子虫，感染的宿主种类多，包括人、家畜及野生动物，通常导致腹泻、腹痛等症状，对免疫功能障碍者则会导致慢性腹泻[2-3]。近年来，国内外对人及动物的微孢子虫流行病学调查和基因型鉴定日益增多，在我国已见于黑龙江、西藏、广东、陕西等地的人、猪、牛以及野生动物感染[3-7]。野鼠是人兽共患病重要的传播媒介之一，因其生存于人类生活区且活动范围较大，易污染食物及水源，增加人类及其他动物的感染风险。关于大理地区野鼠毕氏肠微孢子虫的相关研究尚未见报道，本试验以大理地区的野鼠为调查对象，进行毕氏肠微孢子虫的分子流行病学研究，旨在为当地毕氏肠微孢子虫的防控和研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集 于2016年4月—2017年7月在大理地区居民区放置捕鼠笼，记录所捕获野鼠鼠种、体长等基本信息。共采集到新鲜粪便样本287份，其中褐家鼠样本270份，黄胸鼠样本17份。毕氏肠微孢子虫阳性DNA样本由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

1.2 主要试剂 粪便DNA提取试剂盒，购自甘肃众庆生物科技有限公司；MgCl2、dNTPs Mixture、10×PCR Buffer、DNA marker DL500、TaqDNA聚合酶，均购自宝生物工程(大连)有限公司；Loading Buffer，购自北京天根生化科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA的提取与引物设计 根据粪便DNA提取试剂盒说明书提取野鼠粪便样本DNA，-20 ℃冻存备用。扩增毕氏肠微孢子虫SSU rRNA基因中的内转录间隔区(ITS)，引物序列及扩增方法参考Zhang等[8]发表的研究报道。

1.3.2 产物检测及测序结果分析 将结果中与目的条带大小相近的产物送至金斯瑞生物科技(南京)有限公司进行测序。结果在NCBI上的GenBank中进行同源性比对，根据同源性是否100%确定其基因型或新基因型。用Clustal X 1.83进行序列比对，然后用MEGA 6.0进行进化分析并构建进化树。

1.3.3 统计学分析 应用统计学软件SPSS 19.0对数据进行分析，计算感染率和P值，P<0.05则差异显著。

2 结果

2.1 巢式PCR扩增 基于ITS基因的巢式PCR检测，287份鼠粪便样品中，共有12份扩增出大小约为390 bp的条带(图1)。

图1 野鼠粪便样本毕氏肠微孢子虫PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of E.bieneusi in faecal samples from wild ratsM: DNA marker DL500； 1～8:阳性样品； 9～12:阴性样本；13：阳性对照； 14：阴性对照M：DNA marker DL500； 1-8：Positive samples； 9-12：Negative samples； 13：Positive control； 14：Negative control

2.2 毕氏肠微孢子虫基因型鉴定 对本试验获得的12个阳性样品的测序结果分析，鉴定出3种基因型，上传至GenBank，序列号为MG999509～MG999511。根据其序列进行种系发育比对,其中包括:EbpC(n=3)和D(n=2)基因型；1种新基因型，命名为YNM1(n=7)。在这3种基因型中，共观察到5个多态位点(表1)，分别为序列号150、170、174、198、201。通过构建系谱树(图2)，本试验的基因型EbpC、D、YNM1均属于人兽共患病组(Group1)，基因型D和YNM1属于Group 1a，基因型EbpC属于Group 1d。

图2 毕氏肠微孢子虫进化树Fig.2 Phylogenetic tree of E.bieneusi○: 已知基因型; ●: 新基因型○: Known genotypes; ●: New genotypes

表1 大理野鼠毕氏肠微孢子虫基因型多态位点Table 1 Genotype polymorphic sites of E.bieneusi in wild rats from Dali

2.3 野鼠毕氏肠微孢子虫感染情况统计 287份鼠粪便样品包括黄胸鼠(n=17)和褐家鼠(n=270)两种，感染率分别为4.44%和0，总感染率为4.18%。根据Yan等[9]研究，分为幼年组(体长≤110 mm)、亚成年组(体长110～150 mm)和成年组(体长151～175 mm)。鼠阳性样本中，有8只为雌性(4.57%)，4只为雄性(3.57%)；幼年组有2只为感染阳性(12.50%)，亚成年组有1只被感染(1.37%)，成年组有9只被感染(4.55%)。性别和年龄组感染率差异不显著(P>0.05)。结果见表2。

表2 不同性别及年龄组毕氏肠微孢子虫感染情况Table 2 The infection of E.bieneusi in different gender and age group

3 讨论

通过调查大理野鼠毕氏肠微孢子虫的感染情况，结果显示，其感染阳性率为4.18%(12/287)，其中黄胸鼠、褐家鼠感染率分别为0(0/17)和4.44%(12/270)。在流行相关因素中，性别和年龄组差异不显著(P>0.05)。鼠为啮齿类动物，且种类繁多，国内有关于毕氏肠微孢子虫感染啮齿类动物的报道。本试验捕获的野鼠分为黄胸鼠和褐家鼠，目前国内尚无黄胸鼠感染毕氏肠微孢子虫的相关报道，Zhao等[10]在黑龙江首次检测出褐家鼠中有毕氏肠微孢子虫感染，感染率为7.9%(19/242)。本试验结果与Zhao等[10]的结果和Wang等[11]发现的毕氏肠微孢子虫感染竹鼠的感染率(5.1%)相近。在Gui等[12]的研究中发现，国内青毛鼠和小泡巨鼠感染毕氏肠微孢子虫的阳性率分别为31.6%(37/117)和35.1%(39/111)，高于本次调查的感染率。国外的报道中，黑线姬鼠感染毕氏肠微孢子虫的感染率为42.9%(79/184)，黄颈鼠的感染率为30.0%(18/60)[13]，均高于本次调查。在不同的调查中，鼠被毕氏肠微孢子虫感染可能与啮齿动物的种类、研究地点及其地理条件、收集样品的总数、检测方法等因素有关。

通过分析野鼠的毕氏肠微孢子虫ITS核苷酸序列，鉴定出3种基因型：EbpC(3/12，25%)、D(2/12，17%)、YNM1(7/12，58%)，在这12份阳性样本中，YNM1鉴定出有7份是本试验鉴定出的新型，考虑是大理地区褐家鼠感染毕氏肠微孢子虫的优势基因型。而在国内黑龙江地区褐家鼠的报道中，鉴定出基因型D和Peru6[10]，在海南地区的鼠类动物中鉴定出的毕氏肠微孢子虫基因型多达16种，主要为基因型D(44.2%)[14]。在国外的研究中，也有鼠感染毕氏肠微孢子虫基因型D的报道[13,15]。Matos等[16]的研究表明，基因型D已在40多个国家和地区被发现，是造成多数人感染的原因，同时也从多种动物和废水中检测出[17-20]，故更应关注水源传播和安全用水。基因型EbpC不仅感染人，也出现在许多动物中[21-22]。

毕氏肠微孢子虫基因型的分布可能与地理位置和条件有一定的关系，大理地区野鼠毕氏肠微孢子虫的基因型具有一定的多样性，存在较高人兽共患的风险。本试验结果丰富了大理地区毕氏肠微孢子虫分子流行病学数据，为该病的防控和研究提供了参考数据。